光学切片成像技术在生物三维成像中的应用与展望

在现代生物医学研究中，获取高质量的三维结构和功能信息对于深入理解生物系统的复杂性至关重要。光学显微镜技术作为获取这些信息的关键工具，一直在不断地发展和创新。然而，生物组织的复杂性和光学成像的物理限制，使得三维成像面临诸多挑战。现基于最新研究文献，对光学切片技术在三维生物成像中的应用进行深入解读，探讨其技术创新、实验结果以及未来发展方向。

光学显微镜在生物成像领域具有不可替代的地位，它能够提供亚微米级分辨率的三维结构和功能信息。然而，生物组织的复杂性给三维成像带来了诸多挑战。首先，生物组织中的强烈散射效应会导致成像质量下降，使得远离焦点的荧光背景信号干扰成像。其次，成像技术还面临时空分辨率有限、信噪比低、穿透深度不足以及光毒性高等问题。例如，共聚焦显微镜虽然在固定细胞成像中被广泛使用，但其高光毒性和有限的穿透深度限制了其在活体成像中的应用。而非线性显微镜虽然具有更好的穿透深度，但其时空分辨率较低，难以满足对复杂生物组织进行快速、高分辨率成像的需求。此外，随着成像深度的增加，散射效应会进一步增强，导致成像质量急剧下降，这也成为厚组织成像的主要障碍之一。

共轴成像技术中，照明和检测轴重合，导致焦点内外信号高度混合。其中，共聚焦显微镜是最常用的光学切片方法之一，通过在检测器前设置针孔来阻挡离焦信号，从而实现光学切片。然而，共聚焦显微镜的成像速度和穿透深度有限。为了提高成像速度，多焦点并行扫描技术被提出，通过空间光调制器或微透镜阵列生成扫描网格，实现多点同时激发和检测。此外，线共聚焦显微镜采用线扫描代替点扫描，大幅提高了成像通量，但以降低光学切片能力为代价。多光子显微镜则利用非线性效应，在焦点处选择性激发信号，实现深组织成像，但其成像速度较慢，且对样品的光漂白较为严重。

光学切片方法示意图

共轴和非共轴成像示意图

非共轴成像技术通过分离照明和检测轴，避免了共轴成像中的焦点内外信号混合问题。光片显微镜是典型的非共轴成像技术，通过垂直照明和检测实现光学切片，具有低光毒性和高成像速率的优点，适用于胚胎发育等领域的活体成像。然而，光片显微镜在厚样品成像中，由于散射效应的影响，成像质量会有所下降。线照明调制显微镜（LiMo）等单扫描光学切片显微镜的出现，为厚组织成像提供了新的解决方案。这些方法通过线扫描成像和后期重建算法，实现了速度与光学切片能力的平衡，即使在器官水平也能获得可接受的成像质量。

各类显微镜近期发展的方案

在共聚焦显微镜实验中，使用固定细胞样品进行成像，结果显示共聚焦显微镜能够有效提高成像分辨率和光学切片能力，但在厚样品成像中，其穿透深度和成像速度的不足逐渐显现。多光子显微镜实验中，对活体动物大脑进行成像，成功观察到了单个细胞的生物活动，如钙成像等，验证了其在深组织成像中的优势。然而，多光子显微镜的成像速度较慢，限制了其对快速动态过程的捕捉能力。

对合成样品进行不同光学切片方法的模拟结果

光片显微镜实验中，对胚胎发育过程进行成像，结果显示其低光毒性和高成像速率使得光片显微镜在胚胎发育研究中具有独特优势，能够清晰地捕捉到胚胎的动态发育过程。LiMo显微镜实验中，对厚脑切片进行成像，结果表明LiMo显微镜在保持高光学切片能力的同时，实现了较快的成像速度，适用于全脑成像等大型样品的成像需求。

小鼠脑切片图像

通过对不同技术的实验结果进行比较分析，发现共轴成像技术在薄样品成像中具有较高的分辨率和光学切片能力，但在厚样品成像中受到限制。而非共轴成像技术则在厚样品成像中表现出更好的适应性，能够有效抑制背景信号，提高成像质量。光片显微镜和LiMo显微镜等非共轴技术在成像速度和光毒性方面具有明显优势，适用于活体成像和大型样品成像。此外，不同技术在信噪比、成像深度、光安全性和后处理速度等方面也存在差异，这些因素需要根据具体的成像需求进行综合考虑，以选择最适合的成像技术。

不同应用中的灵活重建实现

光学切片技术在三维生物成像中发挥着至关重要的作用，为生物医学研究提供了强大的工具。共轴和非共轴成像技术各具特色，适用于不同的成像场景和需求。共轴成像技术如共聚焦显微镜和多光子显微镜，在高分辨率和深组织成像方面具有优势，但受限于成像速度和光毒性等问题。非共轴成像技术如光片显微镜和LiMo显微镜，则以其低光毒性和高成像速率，在活体成像和大型样品成像中展现出独特魅力，同时通过技术创新不断克服散射等成像障碍。随着技术的不断进步和创新，光学切片技术将朝着更高分辨率、更深穿透深度、更低光毒性和更快成像速度的方向发展。

声明：本文仅用作学术目的。

Zhang, J., Qiao, W., Jin, R. et al. Optical sectioning methods in three-dimensional bioimaging. Light Sci Appl 14, 11 (2025). 

DOI:org/10.1038/s41377-024-01677-x.