创新组织染色透明在人脑组织三维成像的应用

大脑作为人体最复杂的器官，传统研究受限于组织不透明性，难以实现全脑三维可视化。近年来，组织透明化技术的突破为脑科学研究提供了新工具，其中X-CLARITY™技术显著提升组织透明度和抗体渗透性，成为三维成像的关键技术。发表于《Journal of International Medical Research》的研究中，系统优化了人脑样本的透明化与染色方法，为疾病机制研究提供了新范式。

人脑研究面临伦理、法律及样本获取的多重限制，而啮齿动物模型难以完全模拟人类疾病特征。组织透明化技术通过降低组织折射率实现三维成像，已在动物模型中广泛应用（如iDISCO+、FDISCO、MACS）。其中，CLARITY技术保留蛋白质结构的同时去除脂质，大多数关于CLARITY技术的研究集中在固定的啮齿动物脑组织上，对于人类大脑样本的研究相对较少。尽管已有部分研究尝试将组织透明化技术应用于人类大脑，以探究人类发育异常大脑、阿尔茨海默病、路易体病和自闭症等疾病的发病机制，但这些研究样本缺乏在透明化时间、伪影以及染色效率等方面的定量比较。此外，在抗体染色方法的选择和比较上，相关研究也较为匮乏，而抗体染色通常被认为是人类脑组织透明化研究的主要瓶颈。

提高组织透明化效率：减少透明化所需时间，使新鲜样本达到80%透明度的平均时间从4小时进一步缩短，遗体样本从40小时大幅减少，同时提升透明度质量，降低样本肿胀程度和残留污渍，增强样本处理效果。

降低样本处理成本：简化操作流程，减少实验步骤和所需试剂，降低时间和经济成本，使研究人员能更高效、低成本地使用该技术处理大量样本。

减少伪影干扰：通过改进处理方法，降低因自发荧光和激光散射产生的伪影，尤其是减少尸体样本中的伪影数量和分散度，提高成像清晰度和准确性，避免伪影对研究结果的误判。

增强抗体染色效果：优化染色条件，提高抗体穿透深度，使染色更均匀、稳定，实现更多种类蛋白质的有效染色。

扩大样本适用性：从目前主要针对人脑皮层小样本，拓展到适用于大脑不同区域、不同类型的组织样本，同时更好地处理新鲜样本和尸体样本，减少样本差异对实验结果的影响。

新鲜样本均在死后80小时内收集，暂存于4°C环境，之后将大脑皮层中央沟周围的部分组织在4%多聚甲醛（PFA）中固定1周，再转移至含0.02%叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中保存。遗体样本大脑皮层组织块在4% PFA中固定超过1年，实验前同样浸泡在溶液中。

研究人员选用X-CLARITY™技术对组织样本进行透明化处理。首先，将组织块手工切成约1毫米厚的切片，在水凝胶中孵育1天。对于新鲜样本，前期样本切片较厚，后期样本则借助1毫米网格精确切成1毫米厚。随后，使用X-CLARITY™聚合系统进行3小时聚合反应。聚合完成后，组织块用PBS洗涤3小时，再进行X-CLARITY™透明化处理，直至样本达到理想的透明效果。

为了找到最佳染色方法，研究团队对比了三种染色方案：4天染色法（4DS）、11天染色法（11DS）和使用商业试剂盒的4天染色法（4DS-C）。在4天染色法方法中，预处理后的样本先在含抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体的溶液中孵育4天后洗涤2天，再在其他溶液中孵育4天，最后洗涤2天。11天染色法方法与4天染色法步骤相似，只是一抗和二抗的孵育时间均延长至11天。商业试剂4天染色法方法则先在透化缓冲液中浸泡2天，接着在含GFAP抗体的试剂盒染色缓冲液中孵育4天，洗涤后再在试剂盒染色缓冲液中孵育4天，最后洗涤2天。

新鲜样品和遗体样品的清除效率

成像前，样本需在封片剂中浸泡4小时，以实现折射率的均匀化。共聚焦显微镜使用405nm、488nm和594nm的激光激发波长，搭配10倍物镜和20倍物镜进行图像采集。利用Zen Blue、LAS X和Imaris软件对图像进行可视化和三维渲染处理，以便更直观地观察样本结构。

在数据分析环节，研究人员借助ImageJ软件进行多项指标的量化分析。通过计算样本透明前后的不透明度，评估透明化效率；将样本中自发荧光和激光散射产生的伪影与图像亮度关联，量化伪影水平；依据GFAP抗体荧光亮度估算染色抗原的含量；以DAPI信号亮度衡量DAPI染色效率。

染色抗原的量与死后间隔的关系

研究人员利用X-CLARITY™技术对两种样本进行透明化处理，并详细记录了透明化效率随时间的变化。结果显示，随着透明化时间的增加，两种样本的透明化效率（即透明度）均呈非线性上升趋势（不透明度下降）。新鲜样本平均仅需4小时就能达到80%的透明度，而遗体样本则需要40小时，此外，透明化处理后，两种样本均出现了肿胀现象，综合来看，新鲜样本在透明化时间和质量方面均优于遗体样本。

新鲜样品和遗体样品的染色效率

伪影会严重干扰荧光图像的采集，影响研究结果的准确性。研究人员对比了透明化14小时的新鲜样本和遗体样本的伪影情况，发现遗体样本的伪影更为明显，且分布更为分散。进一步通过ImageJ软件量化分析发现，新鲜样本的伪影与不透明度呈一定相关性，而遗体样本的相关性较弱。即使在相似的不透明度范围内，遗体样本的伪影数量也显著多于新鲜样本。这表明新鲜样本产生的伪影明显少于遗体样本，更有利于后续的成像观察。

新鲜样本和遗体样本的伪影水平

DAPI作为一种能高效穿透组织并对核酸进行染色的纳米级化学染料，其在不同孵育时间下的染色深度在人脑样本中尚未得到精确研究。研究人员对人类大脑皮层进行不同时长的DAPI染色实验，发现当孵育时间超过16小时时，DNA染色深度可超过500μm。而且，随着孵育时间的延长，不仅染色深度增加，样本表面的荧光亮度也有所提高。对比新鲜样本和遗体样本的DAPI染色效果，发现1毫米厚的遗体组织样本在染色4天后，几乎没有DAPI染色信号（仅有自发荧光），即使使用30μm厚的切片也未观察到染色；而新鲜样本在3D透明化的30μm切片中则有明显的DAPI染色。这充分说明DAPI在新鲜样本中的染色效率更高。

在新鲜样本中的穿透深度

研究人员采用4天染色法方法，使用抗体对透明化后的新鲜样本和遗体样本进行染色，以比较二者的GFAP染色效率。结果显示，在相同的透明化时间或相同的透明化效率下，新鲜样本和遗体样本的GFAP染色效果相似。这表明在GFAP染色方面，新鲜样本和遗体样本的表现相近。

染色方法的比较

研究人员对4DS、11DS和4DS-C三种染色方法进行全面比较，评估指标涵盖染色时间、抗体穿透深度、方法复杂度、组织污染程度和成本，结果表明，4DS-C方法的抗体染色深度最深。在方法复杂度方面，4DS-C方法借助商业试剂盒，操作相对简便，组织污染程度较低，染色后产生的可见伪影较少。因此，4DS-C方法在三种染色方法中表现最为出色。

借助优化后的组织透明化技术和4天染色方法，研究人员成功获取了人类大脑的3D图像。使用凝集素作为染色染料，能够清晰呈现血管及其复杂的分支结构。利用抗GFAP抗体，则可观察到结构极为复杂的人类大脑星形胶质细胞。通过组合GFAP染色（显示星形胶质细胞）、DAPI染色（显示细胞核）和凝集素染色（显示血管），还构建出了人类大脑的复合图像。

可视化人脑的三维结构

该研究优化的脑组织透明化和成像方法，是脑科学研究的有力技术支撑。用新鲜样本和4DS-C染色法，能清晰观察大脑三维微观结构，助力了解大脑正常发育和疾病时的结构变化，为揭示大脑奥秘打基础，像研究阿尔茨海默病时可助于探索发病机制。此技术在脑部疾病诊疗上潜力巨大，可帮助医生精准识别病变组织微观特征，提升早期诊断率。治疗方面，依据大脑结构变化设计针对性方案，如针对帕金森病开发神经修复疗法。但未来还需优化染色方案、扩大样本范围、增加样本量、改进成像技术，有望开发更优透明化技术和染色方法，结合单细胞测序等技术，从多层面解析大脑奥秘，推动脑科学发展。  

声明：本文仅用作学术目的。

Kim MS, Ahn JH, Mo JE, Song HY, Cheon D, Yoo SH, Choi HJ. Optimizing tissue clearing and imaging methods for human brain tissue. J Int Med Res. 2021 Mar;49(3):3000605211001729.

DOI:10.1177/03000605211001729.