小鼠大脑微观世界：飞秒双光子荧光三维显微成像技术的前沿研究

一、成像理论基础

1.双光子荧光空间分布

通过对高斯光束复振幅在空间中的分布进行分析，推导出TPF信号的纵向与径向分布公式，揭示了TPF信号强度在空间中的变化规律，为理解成像系统的分辨率和成像深度提供了理论依据。

2.成像深度与分辨率

成像深度与激发光在组织中的散射长度、荧光量子效率、荧光收集效率以及激发光脉冲的重复频率和脉冲宽度等有关，通过合理调整这些参数，可以增加成像深度。而分辨率方面，横向分辨率与激发光波长、物镜数值孔径等因素相关，根据相关公式计算出本实验中成像系统的理论横向分辨率为453nm，纵向分辨率为2.087μm。

小鼠大脑在激发功率下的TPF成像图及变化趋势

二、实验装置与过程

1.成像装置搭建

搭建的TPF显微成像系统包括准直光路、扫描光路、光谱测量光路、显微成像和信号采集装置，激发光源采用钛蓝石飞秒激光器，具有特定的中心波长、重复频率和脉宽，各光路中的透镜、扫描振镜、光电倍增管等部件协同工作，实现对样品的激发、扫描和信号采集。

TPF显微成像以及TPF光谱系统

2.小鼠大脑切片的TPF显微成像实验操作步骤

首先测量罗丹明B溶液的TPF光谱，选择合适的探测窗口。在进行小鼠大脑切片成像时，将样品放置于电动平台，调整焦距和增益档位，选择成像区域。通过扫描光路对样品进行二维扫描，激发荧光并采集信号，最后由电脑处理得到显微成像结果。在实验过程中，还对不同激发功率下的成像结果进行分析，研究荧光强度与激发功率的关系。

显微成像图

一、成像系统性能参数的精确测定

1.成像深度的深度剖析

通过严谨的实验和数据分析，确定了成像系统的成像深度。数值的得出并非偶然，而是在对小鼠大脑切片进行细致的三维重构实验以及对样品关键部位荧光强度数据深入分析的基础上获得的。在实验过程中，我们从样品表面到14μm深度范围内对小鼠大脑切片沿Z轴进行了断层扫描成像，每采集一次图像向下移动1μm的距离，如同在微观世界中逐层揭开大脑的神秘面纱。

通过对不同深度处荧光强度的精确测量和分析，我们发现随着深度的增加，荧光强度呈现出一定的变化规律，而在12.9μm深度之后，成像系统采集到的信号主要为噪声，这表明该深度是成像系统能够有效获取有用信息的极限，从而准确界定了成像深度。这一成像深度的确定为我们在研究小鼠大脑以及其他类似生物样品时提供了一个重要的参考指标，帮助我们了解该成像系统能够深入探测样品内部结构的程度。

断层扫描成像结果及剖面图

2.横向分辨率的精准评估

采用了一种巧妙的方法：在小鼠大脑切片样品中寻找不含组织细胞的狭窄缝隙，通过分析成像结果中这些缝隙位置的强度分布曲线，确定能够分辨的最小距离，从而得出横向分辨率。尽管实验中得到的横向分辨率数值大于理论计算的453nm，但这一结果仍然反映了成像系统在实际应用中的分辨能力。由于样品中可能不存在间距刚好为最小分辨率的理想缝隙，所以实际测量值会受到一定限制，但这也为我们进一步优化实验方法和提高分辨率提供了方向。

在小鼠大脑切片上横向选取的四处含有缝隙的100个连续像素点

二、小鼠大脑微观结构成像的重要发现

1.灰质与白质分布的清晰呈现

实验清晰地展示了小鼠大脑中灰质与白质在不同深度的分布情况。在样品表面，灰质部分相较于白质具有更高的荧光强度，这一现象表明灰质在该区域可能具有更为活跃的分子活动或者更高的物质密度。随着深度的增加，灰质部分的荧光强度逐渐减弱，而白质部分的荧光强度开始增加，在3μm的深度，白质的荧光强度开始高于灰质部分，在6μm的深度，灰质部分的荧光信号几乎消失，强度仅为白质部分的1/18。

这一系列变化揭示了小鼠大脑内部结构的复杂性和层次性。灰质主要存在于样品的浅层，这与灰质在大脑中承担的重要功能密切相关，如信息处理、认知和感知等功能可能主要在浅层灰质区域进行。而白质部分厚度更大且纵向分布更广，这与白质在大脑中负责神经信号传导的功能相契合，其广泛的分布有助于在大脑不同区域之间快速传递信息。

小鼠大脑的灰质与白质组织的平均荧光强度随深度变化曲线

2.荧光强度变化与大脑功能的潜在关联

灰质和白质荧光强度随深度的变化不仅仅是简单的光学现象，更可能与大脑的生理功能有着紧密的联系。灰质荧光强度在浅层较高可能意味着该区域神经元活动频繁，需要更多的能量和物质交换，从而导致较高的荧光信号。而随着深度增加荧光强度减弱，可能反映出随着信号传递到大脑更深层次，神经元活动方式或物质代谢发生了变化。

白质荧光强度在一定深度增加，可能是由于随着深度增加，神经纤维束的结构和组成发生改变，影响了荧光物质的分布和激发效率。这些荧光强度的变化为我们理解大脑功能的分区和神经信号传递机制提供了新的线索，有助于进一步研究大脑在正常生理状态以及疾病状态下的功能变化。

小鼠大脑不同深度的TPF显微成像结果

一、对神经科学研究的深远影响

为神经科学研究提供了一个强大的工具和新的视角，有助于我们更深入地理解哺乳动物大脑的微观结构和神经元作用机制。通过清晰地呈现小鼠大脑灰质和白质的分布以及它们在不同深度的荧光强度变化，我们能够更准确地构建大脑神经网络的三维模型，进一步了解神经元之间的连接方式、信息传递路径以及突触可塑性等关键问题，这对于揭示大脑的认知、学习、记忆等高级功能的神经基础具有重要意义。

在神经疾病研究领域，通过对患病小鼠大脑的成像研究，可以观察到疾病状态下大脑微观结构的异常变化，如灰质萎缩、白质病变等情况，从而深入了解疾病的发病机制。例如，在阿尔茨海默病研究中，我们可以利用该技术追踪神经元之间的连接受损情况，以及神经递质传递过程中的异常变化，为疾病的早期诊断、药物研发和治疗效果评估提供重要的实验依据。

二、推动成像技术的进一步发展

对成像系统性能参数的测定以及实验过程中遇到的问题，为后续成像技术的优化提供了明确的方向。同时，针对成像深度的进一步提升，我们可以研究新型的激光源或光学元件，优化光路设计，减少光在组织中的散射和吸收，从而增加成像深度。此外，提高成像速度也是一个重要的研究方向，这将有助于在活体生物样品研究中捕捉更快速的生理过程，如神经信号的动态传递等。

未来，TPF显微成像技术有望与其他先进技术进行融合，产生更强大的研究工具。例如，与基因编辑技术相结合，我们可以对特定神经元群体进行标记和功能调控，然后利用TPF显微成像技术实时观察这些神经元在生理和病理状态下的变化，实现对大脑功能的精准解析。与光遗传学技术融合，可以在对神经元进行光学刺激的同时进行高分辨率成像，研究神经元活动与行为之间的因果关系。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于：张泽,侯国忠,邓岩岩,章媛,张德林,李兢兢,王雨雷,吕志伟,夏元钦.小鼠大脑飞秒双光子荧光三维显微成像研究[J]. 红外与激光工程,2023,52(8):20230201.DOI:10.3788/IRLA20230201.