大组织成像技术新突破：信号改进型超快光片显微镜（SIFT）

在生物医学研究领域，对大组织进行高分辨率、快速且精确的成像一直是科学家们追求的目标。传统的成像技术在面对这一挑战时，往往存在诸多局限性。共聚焦显微镜和双光子显微镜虽然在细胞成像方面表现出色，但在处理大组织成像时，速度慢、光剂量高、穿透深度浅以及分辨率各向异性等问题逐渐凸显。这些问题使得它们难以满足对大组织进行全面、细致成像的需求。

近年来，光片显微镜（LSM）与组织透明化技术的结合为大组织成像带来了新的希望。组织透明化技术通过改善组织内部折射率（RI）的不匹配，减少了光的散射，使得光能够更深入地穿透组织。这一技术突破使得更多实验室能够将快速三维成像和组织学研究应用于各种生物样本，从小鼠、大鼠、兔子到果蝇，甚至人类组织。然而，即使在LSM技术不断发展的今天，高分辨率成像大组织仍然面临着诸多挑战。

在这样的背景下，一种名为信号改进型超快光片显微镜（SIFT）的新型成像技术应运而生，展示了成像平台在各种透明化组织样本上的性能，并描述了其在各种透明化方案中的稳健性，为大组织成像研究提供了新的解决方案。

1、SIFT的光学设计

双光片同步扫描：SIFT将传统远程聚焦设置分为两个相同的远程聚焦臂，通过精确透镜对组合实现瞳孔匹配，保持光路长度相同，利用透镜的线性运动范围实现焦点的亚像素级运动，两个焦点对称放置且间距固定，由线性聚焦actuator（LFA）同步移动，通过检测物镜成像在相机上，实现了在整个视野（FOV）内的均匀分辨率和高质量同步。

提高成像速度和信号强度：SIFT在特定帧率下，通过双光片扫描，每个光片覆盖FOV的一半，使有效曝光时间翻倍，从而提高信号强度。对于荧光信号强的样本，可在相同检测光子预算和照明功率下，将帧率提高四倍，且在多种组织成像中表现出色，如小鼠前爪和胃的成像实验中，成像速度显著提升。

使用SIFT和各向同性成像的管道

2、深度学习辅助组织边界评估

为了进一步提高成像效率，SIFT引入了深度学习（DL）技术。研究人员精心设计了DL分类算法，这一算法就像一位智能的助手，能够帮助SIFT智能地执行中尺度结构评估任务。可以准确地区分有信息和无信息的图像块，就像在一堆杂乱无章的拼图碎片中，迅速挑选出有用的部分。通过生成组织边界坐标图，SIFT能够精准地定位到组织中真正需要高分辨率成像的区域，避免了对无信息区域的不必要成像，从而大大减少了高分辨率成像的体积。

在实际应用中，这一技术的优势体现得淋漓尽致。例如，在对复杂形状的组织进行成像时，传统方法可能需要对整个组织进行高分辨率扫描，耗费大量的时间和存储空间。而SIFT结合DL算法，能够快速筛选出包含组织信息的区域，只对这些关键区域进行高分辨率成像，大大提高了成像效率。值得一提的是，这个分类器具有很强的通用性，它与标本类型无关，无论面对何种生物样本，都能发挥出色的分类作用。这意味着研究人员在研究不同类型的组织时，无需针对新样本类型进行繁琐的训练，就像一把万能钥匙，能够轻松打开各种组织成像的大门。

显微镜定量和DL网络评估

1、显微镜性能量化

空间分辨率：为了准确评估SIFT的空间分辨率性能，研究人员采用了一种严谨的实验方法。他们将500nm的荧光珠嵌入2%的琼脂糖中，制备成实验样本。随后，将琼脂糖样本安装在定制的支架上，并使用线性压电平台精确地轴向移动样本。在成像过程中，SIFT展现出了令人瞩目的性能，图像的分辨率得到了进一步提升。意味着SIFT能够清晰地分辨出组织内部微小结构的细节，为精准的组织形态学研究提供了有力支持。与传统的成像技术相比，SIFT在空间分辨率上的优势使其能够更准确地揭示组织内部的微观结构和细胞分布。

时间分辨率：时间分辨率是衡量显微镜成像速度的关键指标。SIFT在这方面表现出色，其定义为在最大视野（FOV）下获取一帧图像所需的时间。实验结果表明，SIFT能够在25ms内获取一帧覆盖整个FOV的图像，而传统的则需要100ms。这一显著的速度提升得益于SIFT独特的光学设计，使得两个焦点能够同步移动，有效减少了成像过程中的延迟。通过对比可以清晰地看出，SIFT的帧获取时间相比传统ASLM提高了四倍。这一速度优势在实际应用中具有重要意义，特别是在对动态过程进行成像时，SIFT能够更及时、准确地捕捉到组织内部的变化。

2、多组织成像验证

小鼠前爪和胃成像：研究人员运用SIFT和传统ASLM对小鼠前爪和胃进行了成像实验，以对比两种技术的性能。在对小鼠前爪的成像中，样本经过了组织透明化处理，标记了外周神经、相关细胞以及组织的自发荧光信号（用于显示大体结构，在绿色荧光发射通道成像）。SIFT在成像速度上展现出了巨大的优势，对于双色清除小鼠前爪，SIFT的总帧获取时间仅为4.93小时，而传统ASLM则需要长达19.73小时。在对小鼠胃的成像实验中，同样使用了SIFT和传统ASLM进行对比。SIFT在成像过程中，通过深度学习（DL）算法，从5054个低分辨率图像块中筛选出了2171个包含组织信息的图像块进行高分辨率成像。SIFT的总帧获取时间为6.40小时，而传统ASLM则需要25.63小时。

小鼠前爪和胃的大体积成像

多透明成像：SIFT的多透明物镜是其另一大亮点，使其能够对组织透明化处理并浸于不同折射率介质中的样本进行成像。在对斑马鱼幼虫的成像实验中，研究人员选择了3天受精后的斑马鱼幼虫，将其麻醉后嵌入1.5%琼脂糖中，并安装在氟乙烯丙烯（FEP）管中（其折射率与水匹配）。SIFT能够清晰地观察到斑马鱼幼虫在尾损伤后的炎症反应，以及稳态条件下细胞在整个幼虫体内的发育变化。在对小鼠结肠的成像中，经过整体组织透明技术处理，并进行免疫染色。SIFT的各向同性分辨率使得研究人员能够清晰地观察到结肠组织中神经元的树突和突起，以及神经元之间的连接。在对小鼠脑的成像实验中，分别使用了整体组织透明小鼠脑。SIFT能够对大脑进行高分辨率成像，清晰地显示出神经元的活动和细胞结构，为神经科学研究提供了有力的工具。

多次组织透明成像

这一创新技术通过独特的双焦点成像方案和深度学习分类网络,显著提升了大组织成像的速度和效率。在多种样本成像实验中，SIFT均表现出卓越的性能，无论是小鼠前爪、胃，还是斑马鱼幼虫、小鼠结肠和大脑等组织，SIFT都能以更快的速度获取高质量的图像。其在空间分辨率和时间分辨率方面的优势，使得研究人员能够更清晰地观察组织内部结构，更及时地捕捉动态变化。

SIFT对不同组织透明化方法适应性强，在生物医学成像领域应用潜力大。虽目前成像速度受相机等限制，但为ASLM技术发展提供重要思路。未来，靠改进相机、采用更快LFA或优化控制信号等，有望提升其性能，为生物医学研究开拓更多可能，助力探索生命奥秘、攻克疾病难题。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于：Prince, M.N.H., Garcia, B., Henn, C. et al. Signal improved ultra-fast light-sheet microscope for large tissue imaging. Commun Eng 3, 59 (2024). https://doi.org/10.1038/s44172-024-00205-4.