HDR成像助力免疫荧光优化，开启NSCLC肿瘤组织3D病理评估新维度

一、传统病理检测方法的现状与局限

1.免疫组化（IHC）的主导地位

自20世纪中叶以来，H&E染色联合免疫组化（IHC）一直是标准的病理检测方法。在NSCLC的诊断中，IHC通过抗体与过氧化物酶激活的显色底物相互作用，使目标生物标志物沉淀显色，从而实现可视化定量和分布分析，在诊断新兴生物标志物如PD-L1方面发挥着关键作用，是指导免疫检查点治疗选择的重要依据。临床生物标志物指南目前依赖于可见光染料和模式识别，由经验丰富的病理学家在明场显微镜下对IHC切片进行量化判读。

IHC和IF图像的手动注释和PD-L1表达分析

2.面临的挑战

仅依靠IHC观察肿瘤空间中异质的PD-L1分布颇具挑战。肿瘤组织具有高度复杂性和异质性，PD-L1在肿瘤细胞中的表达并非均匀一致，不同区域、不同细胞亚群之间的表达水平可能存在显著差异，这使得通过传统IHC方法全面、准确地评估PD-L1表达变得困难重重。

二、免疫荧光技术的优势与困境

1.技术特点与应用前景

免疫荧光（IF）技术凭借其在暗场图像中的高灵敏度，在科学研究和临床实验室中广泛用于标记特定生物标志物。通过将荧光团与抗体结合，可以观察生物标志物在组织中的定位和分布。近年来，酪酰胺信号放大（TSA）技术的发展进一步提高了弱生物标志物检测的灵敏度，类似于IHC的免疫过氧化物酶染色机制，且每种荧光团特定的激发/发射光谱允许进行多重染色，可同时观察多个生物标志物，为病理诊断提供了更多维度的信息。

2.实际应用中的阻碍

尽管IF染色在蛋白表达评估方面具有潜力，但在实际病理诊断中仍面临诸多问题。一方面，与传统显微镜相比，荧光显微镜成本效益比和处理程序复杂，限制了其在临床实践中的广泛应用。另一方面，尽管努力优化激发和发射光谱，宽荧光强度范围仍可能影响成像质量。此外，在高级生物研究中，对荧光图像的需求急剧增加，而手动解释暗场（IF）和明场（IHC）图像之间的相关性因非线性人眼响应而具有挑战性，迫切需要在可承受的成本下开发先进的探测器用于常规临床实践。同时，标准化的染色、成像和数字荧光图像后处理过程对于使用荧光技术进行常规临床病理分析至关重要。

三、所需材料与方法

1.标本

30例NSCLC 的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）切片用于实验。

2.染色方法

显色IHC：使用自动染色系统和特定抗体进行。

IF检测：手动进行，包括抗原修复、与一抗和荧光标记二抗孵育，部分使用酪酰胺信号放大（TSA）系统，还涉及不同组织作为阳性和阴性对照。

3D免疫荧光染色：使用100μm厚的FFPE组织切片，经过脱蜡、抗原暴露、与抗体孵育、染色和透明处理等步骤。

图像采集与HDR算法：使用扫描仪获取IHC图像，采用改进的传统HDR算法，包括图像预处理、特定像素采样、线性缩放和后处理等步骤。

统计分析：通过计算机视觉分析估计和比较PD-L1表达面积比例，由病理学家对PD-L1肿瘤比例评分（TPS）进行判读、分类和统计分析。

一、IF和IHC图像中PD-L1表达模式对比

1.实验方法与样本选择

为确定一种能产生与临床IHC检测质量相当的方法，研究人员比较了荧光2'Ab染色方法和TSA系统在检测NSCLC标本中PD-L1表达的效果。选取了具有代表性的NSCLC组织区域样本，包括PD-L1强表达、弱表达以及抗原阴性区域的标本进行实验。

2.实验结果与分析

实验结果显示，两种方法在PD-L1强表达区域均呈现出与IHC相当的完整膜性PD-L1模式。结果表明TSA系统在检测弱表达PD-L1时具有更高的可靠性和特异性，能够更准确地反映肿瘤组织中PD-L1的真实表达情况，减少假阳性和假阴性结果的出现，为后续的研究奠定了更坚实的基础。

PD-L1在非小细胞肺癌切片IHC和IF图像中的表达模式

二、标准IF成像过程中曝光时间的优化

1.曝光时间对成像质量的影响机制

直接影响图像的对比度和亮度，进而影响对PD-L1表达的观察和分析。合适的曝光时间能够确保荧光信号在临床诊断可接受的范围内，避免因过亮或过暗而丢失重要信息，同时减少人为因素对荧光信号水平的干扰，保证成像条件的稳定性和可重复性。

不同暴露时间的IHC和三张IF图像

2.不同曝光时间下的实验数据与结论

研究人员测试了低水平（6.5ms）、中等水平（25ms）和高水平（55ms）三种曝光时间对IF图像中PD-L1表达模式的影响。通过计算机视觉方法计算不同曝光时间下IF图像中PD-L1表达面积比例，并与相应的IHC图像进行比较。结果表明，中等曝光时间下的IF图像与IHC图像在PD-L1表达面积比例上最为相似，中位数绝对误差最小（1.16%），与低水平（9.32%）和高水平（12.55%）曝光时间的IF图像相比具有显著差异（P<0.0003）。尽管中等曝光时间在一定程度上优化了成像效果，但仍需进一步改进以克服设备动态范围的限制，实现更准确的PD-L1表达评估。

IHC和三个不同曝光时间的IF图像中使用计算机视觉分析比较PD-L1表达

三、HDR处理对IF图像动态范围限制的改善

1.HDR处理的原理与优势

HDR处理旨在整合同一幻灯片上不同强度的IF数字信号，以克服检测设备有限动态范围带来的挑战。通过合并不同曝光时间的图像，HDR算法能够扩展图像的动态范围，使原本因过暗或过亮而丢失的信息得以恢复，从而更全面、准确地呈现PD-L1的表达模式。

2.实验验证与效果评估

为验证HDR算法的有效性，研究人员对图像进行了有无HDR处理的对比分析，并通过计算机视觉方法比较PD-L1表达面积比例与IHC的相似性。结果显示，HDR处理后的图像总体误差明显小于未处理图像，中位数绝对误差分别为0.15%和1.16%，有效解决了弱信号丢失和过曝光问题。此外，HDR处理还显著提升了病理学家之间对IF图像TPS分类的一致性，中等曝光IF图像经HDR处理后，75%的病例被两位病理学家分类到相同TPS类别，加权kappa值从0.39提高到0.69。HDR处理不仅提高了单个病理学家对PD-L1表达评估的准确性，还增强了病理学家之间诊断的一致性，减少了主观差异对诊断结果的影响，为临床应用提供了更可靠的依据。

PD-L1表达模式与IHC相似的HDR图像

四、HDR方法在3D免疫荧光成像中的应用与发现

1.3D免疫荧光成像的实验过程与技术要点

研究人员将HDR处理应用于3D免疫荧光检测，以全面展示PD-L1在三维空间中的表达情况。实验采用100μm厚的FFPE组织切片进行3D免疫荧光染色，经过一系列复杂处理后，利用共聚焦显微镜获取不同深度的图像，并对感兴趣区域（ROI）进行高分辨率采集。通过HDR处理整合各层图像信息，以揭示PD-L1在肿瘤组织不同深度的真实表达和变化规律。

2.3D免疫荧光成像结果与意义

在3D荧光成像中，研究观察到了弱信号丢失和强信号过曝光的问题，但经过HDR处理后，IF图像在PD-L1模式上呈现出完整的着色，清晰显示出膜染色。通过HDR处理对3D各层图像的分析，发现肿瘤组织不同深度的PD-L1表达存在显著差异，如在某样本中，表层PD-L1 TPS为40%，而底层为15%。HDR处理后的串行图像经3D渲染后，能够直观展示PD-L1在肿瘤组织中的三维分布情况。这一结果强调了HDR处理在2D和3D荧光成像中的重要性，无需进行硬件升级即可显著提升成像质量，为深入研究肿瘤微环境中PD-L1的分布提供了有力工具，有助于更全面地理解肿瘤生物学行为，为精准治疗提供更丰富的信息。

将HDR处理应用于3D免疫荧光图像以获得完整的PD-L1表达

一、技术应用与评估效果

TSA系统结合调整成像条件和HDR处理，在NSCLC肿瘤组织中PD-L1表达的2D和3D病理评估中具有良好的临床应用价值。优化后的数字IF图像制备过程，在不同深度的肺肿瘤组织中，对于不同水平的PD-L1表达评估展现出较高的准确性和可靠性，其质量与传统IHC图像相当，且能提供更精确的PD-L1表达可视化效果，尤其是在展示肿瘤环境不同深度的PD-L1表达变化方面具有独特优势，克服了传统IHC测试在这方面的不足。

二、对肺癌精准医疗的推动作用

1.精准诊断与治疗决策

2.深入理解肿瘤生物学行为

3D病理分析PD-L1分布为研究肿瘤微环境提供了更丰富的信息，有助于深入理解肿瘤的发生、发展和转移机制。这不仅有助于开发新的治疗靶点和策略，还能为监测治疗反应和疾病进展提供更敏感的指标，推动肺癌精准医疗从诊断到治疗的全方位发展。

人胎盘和扁桃体组织用作PD-L1染色的阳性对照

三、研究的创新点与局限性

1.创新点

本研究的创新之处在于优化了PD-L1 IF检测的全过程，包括染色、成像和后处理，特别是将HDR算法应用于IF图像，有效解决了荧光显微镜检测系统动态范围有限的问题，显著提高了PD-L1表达评估的准确性和一致性。此外，将该方法成功扩展到3D免疫荧光成像，为研究肿瘤组织中PD-L1的三维分布提供了可行方案，这在以往研究中较少涉及。

2.局限性

尽管取得了重要成果，但研究仍存在一定局限性。例如，研究样本量相对有限，可能无法完全代表所有NSCLC患者的情况。此外，虽然HDR处理提高了IF图像的诊断价值，但病理学家对IF图像的解读仍不如对IHC图像熟悉，可能需要额外的培训和更多的临床实践来提高其应用水平。未来研究可进一步扩大样本量，探索更有效的培训方法，以推动该技术在临床实践中的广泛应用。

这项研究在NSCLC的PD-L1表达评估领域取得了显著进展，为肺癌精准医疗带来了新的希望和方向。通过优化免疫荧光技术与高动态范围成像的结合，我们在提高PD-L1表达评估准确性方面迈出了重要一步。然而，要将这些研究成果真正转化为临床实践中的有效工具，仍需要广大科研人员和医务工作者的共同努力。未来，随着技术的不断改进和研究的深入拓展，相信我们将能够更好地应对肺癌这一重大疾病挑战，为患者带来更多的生存希望和生活质量改善的机会。让我们共同期待在肺癌精准医疗领域取得更多的突破和创新。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于：Huang, HN., Kuo, CW., Hung, YL. et al. Optimizing immunofluorescence with high-dynamic-range imaging to enhance PD-L1 expression evaluation for 3D pathology assessment from NSCLC tumor tissue. Sci Rep 14, 15176 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-65187-x.