随着生物医学研究对复杂组织结构和功能的深入探索，高分辨率、高信噪比的深组织成像技术变得愈加重要。传统的显微镜技术往往局限于二维、透明的生物薄样本的观测，这在很大程度上无法满足当前生物医学领域对三维深组织体成像的研究需求。

光片荧光显微镜凭借其低光损伤、高采集速率、大视场、体成像等优点被生物学家广泛使用。然而，生物组织固有的高散射特性仍然为深层成像带来了巨大的挑战。

南京理工大学周笑团队在《激光与光电子学进展》发表文章，重点介绍了光片荧光显微成像技术在深组织成像领域的最新进展，特别是应对高散射样本挑战的解决策略，旨在为相关领域的研究人员提供有价值的参考，助力其对该前沿技术的最新进展和应用前景的理解。

1.基本原理

成像方式独特：光片荧光显微镜采用照明与探测正交的方式进行三维图像采集。激光从一侧对样品照明激发，在与照明光路垂直的方向探测荧光。这种方式与传统荧光显微成像技术相比，只激发焦点处的荧光，有效减少了离焦荧光信号的干扰，从而降低了光漂白与光毒性，同时也减少了背景噪声，极大地提升了成像质量。

光片荧光显微成像原理图和散射成因及影响。（a）照明与探测结构；（b）两种光片生成方式；（c）光入射到Z0处的散射情况；（d）散射后荧光微球的三维PSF

光片形成及影响因素：

2.面临挑战

组织散射限制穿透深度：生物组织固有的高散射特性是深层成像的主要障碍。物理散射由组织结构中的细胞和纤维等散射体引起，光在传播路径上被这些结构阻碍发生偏折和散射。同时组织内的吸收发色团会吸收部分光能，导致光强度衰减。光的散射与吸收共同作用，使得光学显微镜通常只能观察到组织表面几十到几百微米的范围。

高散射样本成像质量问题：在观测如大脑或心脏的厚层切片和肿瘤组织等高散射生物样本时，样本内部复杂结构和光学异质性导致光片在样品内产生严重的散射与吸收，进而引起图像模糊或失真。光片荧光显微镜从侧面一次照亮整个平面的照明方式，还会使采集的数据中存在条纹伪影，降低图像质量，同时散射会减弱焦点处荧光信号，降低图像对比度。

1.激发光调制

无衍射光束应用：研究人员采用贝塞尔光束以及其他无衍射光束代替高斯光束。贝塞尔光束在传播过程中能保持较小束腰尺寸，且具备“自我修复”特性，即使在高散射介质中也能保持较长的均匀光片，有效减少对组织内部成像时的畸变。

例如Planchon等采用扫描贝塞尔光束形成比高斯光束有效长度长3-5倍的光片。艾里光束能产生比相同数值孔径的高斯或贝塞尔光束更薄的光片，虽然其不对称激发模式可能导致图像略显模糊或扭曲，但通过反卷积算法处理可恢复细节。华中科技大学团队提出的双环调制选择平面照明显微镜（IDDR-SPIM）和中国科学院西安光机所团队提出的互补光束相减光片荧光显微成像技术（CBS-LSFM）等进一步优化了贝塞尔光束的应用，减少了图像伪影，提高了轴向分辨率与信噪比。

近红外激发光优势：较长波长的近红外光具有更长的散射平均自由程，在生物组织中传播时更不容易被介质中的小颗粒散射，从而实现更深的组织穿透。

例如Wang等利用近红外二区光片显微镜对小鼠脑组织成像，1320nm激发光能够在甘油清除的脑组织中进行较深和较宽的光学切片成像。目前已开发多种在近红外二区发射的荧光探针，促进了其在心血管疾病、脑部病变和癌症小鼠模型成像中的应用，但开发适用于该光学窗口的探针仍具挑战性。

3种不同模式的光片及近红外激发策略。（a）~（c）高斯、贝塞尔、艾里光片；（d）不同光束类型的光片沿着x轴的传播情况及荧光微球的最大强度投影图像；（e）3种波长的激发光在小鼠脑组织中的穿透深度对比

2.多视图融合

多角度信息获取及融合：多视图融合技术通过同时获取样本不同视角或不同光路的成像信息，并利用融合算法对样本进行三维重建，有效降低了散射的影响，提高了深组织成像的质量。

多视图融合光片显微系统设计。（a）顺序多视图SPIM系统原理图；（b）不同方向的斑马鱼融合图像；（c）双向照明SPIM系统原理图；（d）不同深度斑马鱼脑部图像及其放大区域图像；（e）同步多视图SPIM系统原理图；（f）果蝇合胞胚胎重建图像

不同方法及应用案例：最原始的方法是旋转样本并从不同角度采集图像，如Huisken等采用该方法实现了基因和蛋白质表达模式的高分辨率三维可视化。Ahrens等使用双物镜激发系统提供更均匀的照明平面，有效去除伪影，其轴向分辨率比单向选择平面照明显微镜提高了2倍，且成像速度更快。

华中科技大学龚辉教授团队利用双光束照明和共焦双缝检测提高图像信噪比和质量。为解决顺序多视图成像的时空伪影问题，研究人员开发了同步多视图选择平面照明显微镜（SiMView-SPIM）等技术，可实现几乎完整的样本覆盖，成像速度大幅提高，还有其他如各向同性选择平面照明显微镜（IsoView SPIM）、多视图选择平面照明显微镜（MuViSPIM）和四透镜光片显微镜等技术也在一定程度上优化了系统参数，应用于胚胎发育等多个研究领域。

3.非线性光学

非线性光学效应原理及应用：非线性光学效应是在高光强条件下光与物质相互作用出现的非线性响应，如双光子吸收（2PA）、二次谐波发生（SHG）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS），其中双光子吸收在生物成像中应用最广泛。双光子显微镜基于双光子吸收效应构建，其发光原理是“同时”吸收两个光子形成一个分子进入激发态，再回到基态释放出荧光。这种非线性激发只激发焦点处荧光，显著减弱了光的散射和吸收，相比于传统的单光子宽场荧光显微镜，能够实现更深的组织穿透和更精准的光学切片，通常采用红外激发进一步增强组织穿透能力。

双光子光片显微镜的优势及应用：双光子光片显微镜将非线性激发与正交照明相结合，已成为深组织成像的金标准。它在生物组织中提供至少2倍的穿透深度，同时受散射效应的影响更小。例如Fahrbach等将双光子激发与光片显微镜结合，对比线性和非线性荧光激发贝塞尔光束，证明了非线性激发对旁瓣的抑制作用。Wolf等利用双光子光片显微镜对斑马鱼脑部组织样本成像，北京大学陈良怡课题组开发的双光子三轴数字扫描光片显微镜等都展示了其在成像中的卓越性能，已成功应用于多种生物学研究领域。

非线性光学效应。（a）三种非线性效应；（b）线性与非线性激发特性；（c）线性与非线性荧光激发下贝塞尔光束的Z轴剖面图；（d）荧光微球的线性与非线性激发成像对比；（e）斑马鱼幼虫的全脑区域单光子与双光子激发成像对比

4.波前校正

自适应光学原理及应用：自适应光学最初用于天文望远镜，其核心原理是利用动态元件如可变形镜或空间光调制器进行波前控制，校正成像系统产生的相位畸变，减少系统由光学元件及样品本身引起的像差，从而优化成像系统的性能。波前的校正可通过直接波前传感技术或迭代的无传感器方法实现。

波前校正。（a）探测光路中加入可变形镜的自适应光片显微系统光路图；（b）有无自适应光学校正的转基因斑马鱼图像对比；（c）基于AutoPilot框架的自适应成像系统的自由度和工作流程图；（d）斑马鱼幼体中脑区域自适应校正和未校正的图像对比；（e）自适应晶格光片系统光路图；（f）斑马鱼胚胎脊骨自适应校正前后的切片比较

在光学显微镜中，自适应光学已成为校正像差和恢复衍射极限分辨率的重要工具。应用于光片显微镜方面，Bourgenot等采用无波前传感器的方法，在探测光路中加入可变形镜对转基因斑马鱼成像，极大提高了成像质量，特别是成像深度。Royer等提出基于AutoPilot框架的时空自适应成像方法，可从多个角度捕捉高分辨率生物样本图像，提高空间分辨率和信号强度。还有其他研究将晶格光片显微镜与自适应光学相结合，实现了亚细胞过程的无像差成像。

5.样品处理

早期尝试及局限：在生物学成像领域，早期研究人员尝试通过调整物镜浸没介质的折射率来降低组织的散射，以增强光片的穿透能力，但这种方法在提高样品透明度和穿透能力方面效果有限。

组织透明化和膨胀技术：组织透明化技术着重于将生物样本脱水处理，并用与脂质膜折射率相匹配的油代替水以减少光散射，可使组织变得透明便于显微成像，如Dodt等采用该方法结合双向照明光片荧光显微成像技术实现了对小鼠整个大脑的成像。

样品处理。（a）未处理和经过透明化处理的肺叶对比；（b）组织膨胀前后的小鼠大脑对比；（c）双向照明光片成像系统光路图；（d）由550张光学切片重建的小鼠大脑；（e）部分海马区域的三维重建图像；（f）果蝇神经纤维和突触结构的三维重建图像；（g）小鼠大脑血管网络的三维重建图像

针对组织透明化过程中可能对某些蛋白质或结构造成破坏的问题，研究人员进一步开发了组织膨胀技术，该技术可在保持组织结构的同时均匀地将样品物理放大，使原本低于光学显微镜分辨率的细节特征能够可视化。例如Gao等将膨胀显微镜与超分辨率晶格光片显微镜结合，实现了小鼠和果蝇大脑的近纳米级成像，西湖大学高亮教授团队提出的多功能平铺光片显微镜通过组织膨胀处理提高了分辨率。

1.发育生物学

实时活体成像优势：光片荧光显微镜因其低光毒性和光损伤特性，成为实时活体样本成像的理想选择，最初主要应用于发育生物学领域。

应用案例及成果：Keller等利用数字扫描光片显微镜实现了对斑马鱼胚胎发育初期细胞核定位和运动的亚细胞分辨率成像；Chhetri等开发的各向同性多视图光片荧光显微镜实现了对果蝇原肠受精胚胎发育过程的多视图反卷积成像；McDole等开发的自适应成像框架可对小鼠胚胎从原肠胚形成到早期器官发育的过程进行成像；Daetwyler等同时对多个斑马鱼胚胎样品进行成像，为定量研究生物过程提供了基础。这些方法有助于研究人员深入观察胚胎发育及神经系统发展等复杂生物过程。

光片显微成像在发育生物学中的应用。（a）斑马鱼胚胎发育过程中细胞和基因表达成像；（b）（c）果蝇原肠受精胚胎的多视图成像；（d）小鼠细胞水平发育的长时间实时成像；（e）表达荧光血管标志物的斑马鱼胚胎成像

2.神经科学

适用于神经系统研究：光片荧光显微成像技术能够在最小的光损伤下以快速、高对比度的光学切片成像大型三维样品，因此非常适于获取神经系统的功能成像和大脑的形态学研究。

应用案例及成果：Ahrens等开发的同步多视图光片显微镜记录了斑马鱼大脑中几乎所有神经元单细胞分辨率成像；Xiao等采用晶格光片显微镜研究斑马鱼神经损伤模型中细胞间的相互作用；Pan等开发的组织透明化溶液使器官和动物身体透明，结合光片显微镜对神经和血管系统成像，可观察单个神经元和突触的结构；de Medeiros等采用四物镜光片显微镜结合短红外激光脉冲实现了对斑马鱼亚细胞水平的神经元成像。这些研究有助于深入了解神经系统的结构和功能，以及实时监测神经活动。

光片显微成像在神经科学中的应用。（a）斑马鱼全脑神经元多视图成像；（b）对比异基因与同基因斑马鱼的后神经节和侧线的正常与异常表达模式成像；（c）成年小鼠中央神经系统成像；（d）在斑马鱼大脑中进行的单个神经细胞体和轴突实时成像

3.组织病理学

活体组织检查优势：光片显微镜提供了一种快速、无需切片、低光漂白、非破坏性的活体组织检查方法，吸引了临床病理学家的广泛关注。

应用案例及成果：Glaser等开发的非破坏性开放式光片显微镜可实现横向无约束成像，用于术中对新鲜人类前列腺组织和乳腺组织的病理成像；Migliori等开发的光片θ显微镜从检测物镜同一侧均匀照亮样品，对人脑厚冠状板进行快速高分辨率定量成像；Glaser等进一步开发的多浸入的开放式光片显微镜可对组织透明化的标本进行便捷的高通量成像。光片荧光显微成像技术可帮助病理学家更好地了解组织的生长和形态变化，提高诊断疾病和分期病变的能力。

光片显微成像在组织病理学中的应用。（a）人类前列腺组织病理成像；（b）人类乳腺组织病理成像；（c）肾切片及单个肾小球、血管、肾小管及多通道DAPI对染成像

光片荧光显微成像技术凭借其独特的照明和探测方式，具备低光损伤、高分辨率和快速三维体成像等特性，优化了传统显微成像效果，成为生物医学领域的重要工具。

面对生物样本的多样性与复杂性带来的光散射与组织穿透能力的局限，研究人员通过多种技术优化突破了这一难题，使其在深组织成像领域广泛应用。

该技术不仅能揭示单个细胞的结构和功能，还能深入到细胞群体中观察互动和通讯，为理解复杂生物过程提供新视角，预示着更多科研突破和医学应用的可能性。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于:周笑, 左超, 刘永焘. 深组织光片荧光显微成像研究进展（特邀）[J]. 激光与光电子学进展, 2024, 61(2): 0211010. Xiao Zhou, Chao Zuo, Yongtao Liu. Advances in Deep-Tissue Light-Sheet Fluorescence Microscopic Imaging (Invited)[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2024, 61(2): 0211010.