光片显微镜由于具有强大的光学层切能力、较快的成像速度和较低的光损伤，成为三维成像的重要工具。光片显微镜通常利用两个垂直放置的物镜分别进行照明和成像，这带来了对样品的空间限制并禁用了高数值孔径的成像物镜。

以倾斜平面照明和微镜微器件反射技术为代表的单物镜光片显微技术突破上述限制，展示出在高分辨率和体积高速成像方面的优势，并且可与超分辨显微术等多种技术结合，在近年来取得了巨大发展。

中国科学技术大学的张一凡团队发表综述文章《单物镜光片三维荧光成像技术研究进展（特邀）》，介绍了单物镜光片显微成像技术的原理、关键性能的提升和其在生物医学的应用。

光学显微镜是生命科学研究的重要工具。20世纪80年代，共聚焦显微镜和双光子显微镜出现，赋予了显微镜三维解析能力，但存在光毒性和光漂白问题。

2004年，光片显微镜（LSM）出现，其激发光经柱透镜在样品上形成光片，限制了照明范围，减少了光损伤和光漂白。2008年，数字激光扫描显微镜（DLSM）是另一种形成光片的方法。

传统光片显微镜由照明光路和探测光路组成，通常需要两个正交的物镜。但双物镜的使用带来了一系列问题，如样品装载手段复杂、不能使用常用载玻片、限制样品种类和安装，需要物镜有较长工作距离，限制了高分辨率图像的获得，两个光路间还需要精确对焦。

两种单物镜光片照明方式与传统光片的照明方式。（a）传统的光片显微镜，两个物镜正交放置，一个用于照明，一个用于成像；（b）倾斜平面照明显微镜，直接将照明光引入物镜，在样品表面形成倾斜的光片，适配于载玻片装载的常规样品；（c）应用于微器件通道的单物镜光片，将倾斜45°反射微镜设计在微器件上，形成的光片直接垂直于光轴

而以倾斜平面照明和微镜微器件反射技术为代表的单物镜光片显微技术突破了上述限制，并展示出了在高分辨率和体积高速成像方面的优势。

倾斜平面照明显微镜（OPM）

2008年，Dunsby发明了倾斜光片照明显微镜。它把柱透镜生成的片状照明光引入原先探测物镜的光路，同时在成像光路中设计了远程聚焦系统，引入二级和三级物镜来复制和成像样本的三维信息。

倾斜平面照明显微镜光路，用同一物镜生成光片并成像，引入远程聚焦系统修正照明角度倾斜

三维成像扫描方式

多视图光片成像

在实际成像过程中，光片穿过样品会因为散射、吸收等问题导致光衰减，尤其是在脑组织等复杂生物样品中，散射会让图像质量下降很快。多视图光片显微镜就可以解决这个问题，它利用两个或多个不同方向的光片照明，获得多个视角的图像，再通过图像融合算法把这些图像组合起来，减少散射引起的伪影，得到各向同性分辨率的图像。

基于微镜反射的单物镜光片显微镜

针尖微悬臂反射镜

2013年，Gebhardt等开发了利用原子力显微镜（AFM）臂的反射型光片显微镜，斜入射的光片在壁上反射照明样品。2018 年，Ponjavic等利用原子力显微镜的单臂也开发了一种单物镜光片显微镜。

微流控制备微反射镜器件

2015年，Galland等设计了一款特别的单物镜光片显微镜。它不需要远程聚焦系统，光片方向垂直于物镜光轴。它使用定制的样品装载容器，把45°反射微镜放在硅片的微孔里。照明光束从物镜后焦面斜入射，经反射后形成垂直光轴的照明光片。这个显微镜还可以和倒置商用标准显微镜兼容，能使用多种物镜，生成不同厚度的光片，满足多种尺度的研究需求。

空间分辨率

OPM虽然解决了正交光片显微镜不能使用高数值孔径物镜的问题，但实际使用中，物镜的高数值孔径并不能完全被利用。这是因为照明光束会分占一部分数值孔径，而且远程聚焦系统中第二物镜与第三物镜倾斜放置，导致光不能完全中继到第三物镜上。

不过，研究人员也找到了一些解决办法，比如E-OPM通过在三级物镜之前增加类似“水箱”的设计，利用水和空气的折射率差，把更多光折射进三级物镜，提高了数值孔径的利用率。

OPM中的数值孔径减小与分辨率仿真。（a）初级物镜的照明角度与收集的关系图解；（b）不同倾斜角度下有效光瞳面积的示意图，其中NA=1.4，折射率n=1.52；（c）NA=1.30，1.40，1.49，倾斜角分别为0°、30°、60°、90°的情况下对PSF进行仿真的结果

成像视场

三级物镜远程聚焦系统对显微镜的视场范围有影响。光片显微镜的轴向分辨率和视场是相互制约的。在倾斜光片显微镜中，远程聚焦系统是视场限制的主要原因。

为了增大视场，研究人员想出了很多方法，比如扩展平面成像、利用反射闪耀光栅、利用Scheimpflug条件等，还有一些新颖的方案是取消远程聚焦系统。

几种提升OPM性能的方法。（a）玻璃尖端的三级物镜；（b）利用微镜阵列增加分辨率；（c）加入微透镜阵列，通过计算方法直接成像；（d）二级光锥损失示意图，低数值孔径物镜光锥全部丢失，引入光栅反射对光束进行重新定向；（e）插入椭球镜改善视场

倾斜平面照明显微镜的生物医学应用

光片显微镜因为光毒性低，常被用于活体胚胎等大样本的长时间发育成像。单物镜光片显微镜更是把振镜扫描方式引入光片显微镜的三维成像，极大地提高了体积成像速度。

这对于神经活动、心脏跳动及血流动力学等高速生命活动的观测非常有帮助。比如可以对心脏中的钙火花进行3D成像，观察心肌细胞收缩活动中的钙波传输等。

它还可以用于高通量成像，像结合声流控聚焦设计多色3D成像流式细胞术，同时对多个细胞进行检测。在医学检验方面，也有应用，比如开发了Medi-SCAPE用于活体肿瘤监测，还应用于眼科成像，对眼底视网膜进行三维成像，检测血流动力学等。

倾斜平面照明显微镜用于快速生命活动成像。（a）OPM实现对心脏中钙火花的3D成像；（b）OPM实现对心肌收缩钙波传播的观测；（c）SCAPE 2.0以321 volume/s的体积成像速度实现对心脏与心房间的血流动力学观测

OPM在生命科学与医学检查场景的广泛应用。（a）OPM的高分辨率成像；（b）OPM用于流式细胞检测；（c）DaXi-OPM实现对9个斑马鱼胚胎的同时成像；（d）Medi-SCAPE用于活体肿瘤检测；（e）利用人眼作为天然物镜，实现对眼底视网膜成像

基于微镜反射的单物镜光片显微镜的生物医学应用

这类显微镜可以使用高NA物镜对多孔板进行成像，移动位移台时不需要重新聚焦样品。

它与倒置商用标准显微镜兼容，能满足多种应用需求。比如在生物微器件研究中，可以用于类器官培养，获取全细胞超分辨图像，开发流式细胞术等。

微镜反射的单物镜光片显微镜。（a）基于45°微镜的单物镜光片显微镜的光路，右上角为扫描电子显微图像；（b）利用ETL进行轴向位移，使光片中心横向位置保持不变

单分子定位超分辨成像

典型的单分子方法如STORM，单分子超分辨方法中荧光信号微弱，图像信噪比越高，单分子定位精度越高。光片显微镜具有低背景荧光的优势，与单分子定位技术结合后，可将厚样本纳入研究范围，在多种单物镜光片架构中都有应用。

结合单分子定位方法的单物镜光片显微镜。（a）soSPIM-PLAM成像，左边宽场，右边超分辨；（b）soSPIM-dSTORM超分辨成像，左边宽场，右边超分辨；（c）组织深度为 50 μm的代表性体积obSTORM图像，十张图像堆叠，深度颜色编码；（d）obSTORM高倾斜角度的光片入射；（e）光片角度下理论和实验PSF的对比

结构光照明超分辨成像

SIM超分辨显微术具有相对较快的速度，与光片技术常用于活细胞的成像场景。单物镜的架构为结构光带来了新机遇，如2022年Chen等的设计用一个带有振镜与静态镜组合的图像旋转器的单物镜光片显微镜，可获得各向同性的超分辨图像。

超分辨结构光的倾斜平面照明显微镜。（a）同一显微镜下宽场成像和结构光超分辨成像对比；（b）三个方向，每个方向拍摄3张不同相位的图片进行重建获得超分辨图；（c）SIM-OPM结构光超分辨显微镜光路简图

光片显微镜因光学切片及与多种光学技术的适用性而迅速发展。单物镜光片显微术有诸多优点，解决了传统光片显微镜的载玻片使用、几何空间限制及正交光片显微镜不能用高NA物镜的问题，联合超分辨成像技术后分辨水平进一步提升，推动了其在生物学实验室的应用，适用于高速生命活动观察和在体成像场景，是快速体积成像利器。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于:张一凡, 李辉, 杨光. 单物镜光片三维荧光成像技术研究进展（特邀）[J]. 激光与光电子学进展, 2024, 61(6): 0618014. Yifan Zhang, Hui Li, Guang Yang. Advances in Single-Objective Light Sheet Three-Dimensional Fluorescence Imaging (Invited)[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2024, 61(6): 0618014.