关键提升！自适应光学在双光子显微成像技术中的应用

光学显微镜是生物医学研究必不可少的工具，其中双光子显微成像技术具有大深度三维显微成像功能，被认为是深层生物组织研究的首选工具。

但是，在双光子成像系统使用过程中，光学系统的装配偏差、光学元件不理想以及生物样品的不均匀性都会在成像过程中引入像差，从而降低成像质量。通过在双光子显微成像系统中引入自适应光学技术，可实现对像差的有效校正，从而提高成像的分辨率、深度和视场。

深圳的章辰、高玉峰团队在《中国激光》发表文章，介绍了双光子显微成像中的像差来源和特点，概述了自适应光学技术中不同的探测和校正方法，综述了近年来自适应光学技术在双光子显微成像中不同的应用成果，最后对自适应光学在双光子显微成像中的发展进行了展望。

双光子显微成像技术是基于双光子效应实现的。在一般情况下，荧光分子会吸收一个高能量的光子，从基态跃迁至激发态，经过一段弛豫时间后回到基态，同时辐射出一个能量比激发光光子能量小但是波长更长的光子，这就是单光子效应。

然而，在高光子密度的条件下，荧光分子可同时吸收两个能量较小、波长较长的光子，从基态跃迁至激发态，随后在激发态弛豫一段时间后再回到基态，这时辐射出能量比激发光光子能量高但是小于两个光子能量总和的光子，这就是双光子效应。

激发原理图。（a）单光子激发原理示意图；（b）双光子激发原理示意图

双光子显微成像系统中的像差主要有两个来源：一是由光学系统装调和光学元件不理想引入的像差，称之为系统像差；二是由生物样品的折射率不均匀性引入的像差，称之为样品像差。

其中，系统像差通常为固定的低阶像差，不随时间变化，因此可以通过对光学系统的优化设计来减小像差，同时也可以预先测量、标定和补偿像差。与系统像差相比，样品像差除了大部分的低阶像差以外，还包括更复杂的高阶像差，这些像差通常会随着成像深度的增加而增大。由于不同样品或同一样品不同区域的散射体大小和折射率不尽相同，不同样品或同一样品不同区域产生的像差也不一样，因此样品像差是无规律的、不可预测的，这也是双光子显微成像系统中最主要也是最难消除的像差。

双光子显微成像系统包含了激发光和发射光两条光路，激发光在生物样品上聚焦以激发荧光物质发出荧光。而生物样品的折射率不均匀性会降低激发光的聚焦能力，进而影响荧光发射。因此在进行像差补偿时，对激发光光路进行像差校正是必须的。对于发射光而言，通常采用光电倍增管（PMT）进行点探测成像，成像过程实际上是对荧光能量进行收集，发射光光路中的像差对成像质量的影响可忽略，因此无须对发射光光路进行像差校正。

在AO技术中，通常把波前探测方法分为两类：一类是使用波前传感器（WS）基于几何光学原理对波前进行探测，称之为直接波前探测；另一类是不使用波前传感器，而是通过优化算法对一系列图像进行计算，推导得出波前，称之为间接波前探测。

间接波前探测

间接波前探测的概念最早来自1974年出现的像清晰化技术，但是随着20世纪90年代后期硬件技术的革新和优化控制算法的更新，间接波前探测的应用才开始蓬勃发展起来。间接波前探测无需专门的波前传感器，直接利用成像探测器获得的光强信息建立像质评价函数，然后基于特定的优化算法在波前校正器上附加某些特定的相位，以寻找评价函数的极值，达到获取最优信号强度的目的，当评价函数达到极值时认为畸变波前已得到了校正。间接波前探测又可细分为搜索算法和模式法两大类。

直接波前探测

直接波前探测是通过波前探测器和波前重建算法来获得畸变波前的相位分布，然后将相位信息反馈给波前校正器，波前校正器产生一个与畸变波前互补的补偿波前，从而达到波前校正的目的。常用的波前探测器是夏克-哈特曼波前传感器（SHWS），其工作原理是首先利用微透镜阵列把畸变波前分割成多个小块并聚焦到照相机的靶面上，通过照相机采集各个焦点的空间位置信息，然后计算各个焦点与微透镜阵列理想中心点的偏移量，得到畸变波前的斜率分布，最后根据Zernike梯度多项式计算得到畸变波前的相位分布。

干涉测量技术

干涉测量技术是另一种非接触、高精度的直接波前探测技术，目前在天文探测、光学元件精密制造、眼科治疗等领域中得到广泛应用。在干涉测量技术中，通常使用相移法使参考光与被测光之间产生稳定变化的相位差，通过多幅相位差图像计算出两束光波前的相位差信息，再根据干涉测量的具体工作原理，得到被测光路中的畸变波前相位分布。随着科学技术的发展，干涉测量技术已从一种静态测量技术发展为动态测量技术，其测量速度已使其可以用于活体成像。

波前校正方法

波前校正器是AO系统中进行像差校正的执行器件，通过改变入射光束不同位置的光程差来进行畸变波前的相位补偿。波前的畸变在本质上是光程的差异，光程可表示为光在传输介质中经过的路程与传输介质折射率的乘积，因此可以通过改变光在传输介质中经过的路程或改变传输介质的折射率来对畸变波前进行补偿。

因此，波前校正器可分为两类：一类是通过改变传输介质折射率来实现相位补偿的波前校正器，如液晶空间光调制器（SLM）；另一类是通过改变光在传输介质中经过的路程来进行相位补偿的波前校正器，如变形镜（DM）。

SLM进行相位调制是通过偏转液晶面板上的双折射液晶分子来实现的：在液晶面板的两端施加不同的电压，双折射液晶分子随着电压的变化而产生不同的偏转角度，使液晶面板的折射率发生变化，从而改变穿过液晶的光程，实现相位调制。此外，可以通过调制电压独立地改变SLM上每一个像素对应的液晶分子折射率，实现高空间分辨率的相位调制。但是，SLM具有偏振依赖性，入射光必须为线偏振光才能实现相位调制，大大降低了器件的光能利用率。因此，在双光子显微成像系统中，必须提高激发光的功率，才能保证SLM校正后的激发光能量足以激发荧光。

DM是通过改变反射镜的表面形状来改变DM反射的光程，从而实现相位补偿。根据驱动器的不同，常用的DM有微机电系统（MEMS）变形镜和压电陶瓷变形镜。MEMS变形镜采用的是微机电技术，主要由镜面层、电极层和基底层组成，反射镜为反射率较高的镀铝或镀银薄膜，在给电极层上分布的各个电极施加不同的电压后，镜面层与电极层之间会产生电势差，从而产生静电力吸附薄膜，使反射镜产生形变。压电陶瓷变形镜是通过改变压电驱动器的控制电压来实现驱动器的伸缩，进而带动驱动器支撑的反射镜产生形变。相比于SLM，DM的校正速度更快，也无偏振依赖性，但是DM的空间分辨率受驱动器个数的限制，且价格相对昂贵。

具有高成像分辨率及大成像深度和视场的显微成像技术一直是双光子显微成像乃至整个显微成像领域的研究热点，其中AO技术在探测和校正像差中发挥了重要作用。自2000年AO技术首次被应用于双光子显微成像以来，不同探测方法和校正方法的成功应用使得具有大视场、高成像分辨率的深层生物组织活体成像成为可能。

间接波前探测方法在双光子显微成像中的应用

1.基于子孔径分割的算法

Ji等提出基于子孔径分割的间接波前探测算法，使用SLM调制波前相位，对小鼠大脑皮层切片产生的像差进行预校正，能达到近衍射极限的成像分辨率；Tang等提出二分迭代法的间接波前探测算法，提高了波前探测速度和成像分辨率，实现了活体小鼠大脑皮层神经元的成像；Wang等引入数字微镜器件（DMD），缩短了校正时长，实现了活体小鼠大脑皮层神经元的成像；Rodríguez等设计了更紧凑的子孔径探测模块，实现了活体小鼠大脑皮层和脊髓中神经元的结构成像以及脊髓神经元中钙离子的功能成像，在三光子显微成像系统中进一步提升了成像深度；本课题组提出环形子孔径分割算法，用于校正旋转对称像差，能达到近衍射极限的成像分辨率。

基于SLM间接波前探测的双光子显微成像系统。（a）子孔径分割技术的工作原理；（b）系统校正和全局校正的置于250μm厚小鼠脑片下的直径为1μm的荧光小球成像及全局校正波前图

基于二分迭代法间接波前探测的双光子显微成像系统及其成像结果。（a）光路示意图；（b）小鼠大脑皮层第5层神经元的成像结果

基于DMD和SLM的子孔径分割双光子显微成像系统及其成像结果。（a）光路示意图；（b）校正前、后的活体小鼠大脑皮层第4、5层神经元的成像结果

基于子孔径分割的多光子显微成像系统及其成像结果。（a）双光子和三光子显微成像系统的光路示意图；（b）校正前、后活体小鼠大脑皮层和海马体中神经元的三光子显微成像结果

2.基于模式法的算法

Park等提出基于模式法的间接波前探测方法，实现了大视场像差校正；Streich等将基于模式法的无波前探测技术引入到三光子显微成像系统中，增大了成像深度；研究团队对视场进行子孔径分割，提高了视场边缘的成像分辨率，实现了大视场成像。

间接波前探测方法结构相对简单，对成像对象无限制，易于实现，但波前校正过程计算量大、耗时长，很难满足快速成像需求，测量精度低于直接波前探测。

基于环形子孔径分割的双光子显微成像系统及其成像结果。（a）环形子孔径分割的原理示意图；（b）校正前、后小鼠大脑皮层神经元的双光子显微成像结果

多孔径间接波前探测技术的工作原理和成像结果。（a）多孔径波前探测原理示意图；（b）活体小鼠的大脑皮层神经元成像结果

基于模式法的间接波前探测三光子显微成像系统及其成像结果。（a）光路示意图；（b）活体小鼠大脑海马体神经元的三光子显微成像结果

大视场双光子显微成像系统及其成像结果。（a）光路示意图；（b）校正前、后小鼠大脑切片的双光子显微成像结果

直接波前探测方法在双光子显微成像中的应用

1.使用外源荧光物质作为引导星

Cha等、Tao等在样品里注射外源荧光物质作为引导星，对离体小鼠大脑组织进行成像，提高了成像分辨率，但该方法会对样品产生干扰且引导星空间位置难精确控制，未被广泛使用。

2.使用双光子激发的荧光作为引导星

Wang等认为双光子激发的荧光可作为引导星，提出去扫描技术提高直接波前探测的质量和效率，使用SLM对激发光进行校正，对开颅活体小鼠大脑皮层神经元进行结构成像，将引导星改为近红外荧光蛋白，对活体小鼠大脑皮层神经元中的钙离子传导进行功能成像，成像深度达700μm；Liu等将近红外荧光染料作为引导星，将波前校正器换成DM，对小鼠大脑皮层中的微血管和神经元进行结构成像，成像深度可达1100μm，对神经元释放谷氨酸和钙离子的过程进行功能成像，提升了成像质量；Qin等将DM置于去扫描后的探测光路中，实现了对激发光的迭代校正，优化了波前重建算法和双光子显微成像系统中激发光的数值孔径，降低了激发光的散射效应，增加了探测深度，通过与光透明技术结合，实现了小鼠颅骨完整状态下大脑皮层神经元的成像，成像深度为700μm。

基于直接波前探测的双光子显微成像系统及其成像结果。（a）光路示意图；（b）校正前、后果蝇胚胎的双光子显微成像结果

基于SHWS和SLM直接波前探测的双光子显微成像系统及其成像结果。（a）光路示意图；（b）校正前、后小鼠大脑皮层神经元的双光子显微成像结果

基于SHWS和DM直接波前探测的双光子成像系统及其成像结果.（a）光路示意图；（b）系统校正和全局校正后的小鼠大脑皮层树突棘的双光子显微成像图；（c）校正后的小鼠大脑皮层神经元的双光子显微成像图

基于数值孔径优化算法和直接波前探测的双光子显微成像系统及其成像结果。（a）数值孔径优化示意图；（b）校正前、后活体小鼠脑膜下方神经元的双光子显微成像图

直接波前探测方法能够得到畸变波前的客观描述，测量速度更快、准确度更高，但系统结构复杂，会降低成像信噪比，波前探测器的灵敏度和探测精度也会受信噪比影响。

F-SHARP技术在双光子显微成像中的应用

1.技术原理

Papadopoulos等提出聚焦扫描全息像差探测（F-SHARP）方法，通过双光束干涉直接测量畸变波前的点扩散函数（PSF），并使用测量得到的PSF相位的共轭来校正波前。

2.应用进展

Qin等在F-SHARP系统中将远程聚焦方法与共轭AO相结合，使用锁相放大器简化PSF的测量步骤，提高了畸变波前的测量速度和准确度，将改进后的F-SHARP技术应用于三光子显微成像系统中，实现了小鼠大脑皮层神经元的结构成像和海马体的高分辨率成像。

基于F-SHARP的双光子显微成像系统及其成像结果。（a）光路示意图及F-SHARP工作原理；（b）校正前、后小鼠大脑皮层神经元的双光子显微成像图

基于共轭AO和锁相放大器的F-SHARP三光子显微成像系统及其成像结果。（a）光路示意图；（b）系统校正和全局校正后的活体小鼠大脑皮层的双光子显微成像图

3.技术特点

无需专门的波前传感器，将发射光全部用于成像，保证了成像信噪比；使用双光束干涉技术，部分激发光功率损失，但探测时间大幅缩短，与快速相移技术结合，探测速度进一步提升。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于:章辰, 高玉峰, 叶世蔚, 李慧, 郑炜. 自适应光学在双光子显微成像技术中的应用[J]. 中国激光, 2023, 50(3): 0307103. Chen Zhang, Yufeng Gao, Shiwei Ye, Hui Li, Wei Zheng. Application of Adaptive Optics in Two‑photon Microscopic Imaging[J]. Chinese Journal of Lasers, 2023, 50(3): 0307103.