低功率STED超分辨显微成像技术的发展与展望
受激辐射损耗（Stimulated emission depletion,STED）是一种功能强大的远场超分辨显微成像技术，已广泛用于细胞和组织切片等生物样品的超分辨成像。通过增加损耗激光的功率，可以显著提高STED超分辨成像的空间分辨率和成像深度。然而，过高的激光功率会引起严重的光漂白及对生物样品的光毒性。
因此，如何在保证成像质量的同时，有效降低STED超分辨成像所需的损耗激光强度，是目前STED技术在生物成像领域面临的关键挑战。
深圳大学物理与光电工程学院的周浩贤、王璐玮团队在《中国激光》发表文章，从STED成像的基本原理出发，分别从STED探针、单分子定位、图像处理和时间分辨探测等四个方面探讨了实现低功率STED超分辨成像的策略。
STED超分辨成像的基本原理
STED技术通过在传统激光扫描共聚焦成像系统中增加一束波长红移的损耗激光，利用受激辐射的物理原理提升成像分辨率。
从空间维度来看，该技术利用两束波长不同的激光实现荧光“开关”态的调控，在空间上压缩荧光团分子发射荧光的范围，突破光学衍射极限；从时间维度来看，处于基态的荧光分子受激吸收跃迁到第一激发态，经过振动弛豫后，引入环形长波长激光，使处于特定能级的荧光分子通过受激辐射返回基态高振动能级，只有激发光斑中心的激发态分子通过自发辐射返回基态并发射荧光，探测器接收自发辐射产生的荧光信号，从而缩小点扩散函数，提升分辨率；从光谱维度来看，激发光波长应在荧光染料的吸收光谱峰值波长附近，损耗光波长应在荧光染料发射光谱的尾端。
受激辐射损耗技术原理图。（a）成像原理示意图；（b）STED成像中分子的Jablonski能级简化示意图；（c）Atto 647N染料光谱图和STED超分辨成像系统参数
根据激光类型，STED技术分为脉冲型和连续型。脉冲型技术要求激发和损耗光斑精准重合，且损耗激光脉冲相对于激发光脉冲有一定时间延迟；连续型技术中，激发光通常为脉冲激光，损耗光为连续激光，虽降低了成像系统的复杂度和成本，但在相同激光功率下，连续型需要更高的功率才能达到与脉冲型相同的分辨率，会加剧对染料的光漂白和对样品的光毒性。
环形光斑的生成方式有涡旋相位板和空间光调制器两种。涡旋相位板采用激光透射方式，能量利用率高，适用于固定波长；空间光调制器采用激光反射方式，适用于多种波长，可编程能力强，可用于波前像差校正等。
低功率STED超分辨成像策略
一、低饱和强度荧光染料开发
有机小分子染料：包括罗丹明、香豆素和菁染料等，具有较小分子量、优良荧光性能、易于修饰和良好生物相容性。但普遍具有较高饱和强度，在实现亚百纳米分辨率时需要高损耗光强度，且光稳定性差、多次扫描后荧光强度急剧下降，不适用于常规STED成像。
荧光纳米材料：纳米材料分为有机纳米材料和无机纳米材料，相对于有机小分子染料，纳米探针粒径较大，但具有更高发光效率、更长荧光寿命和更强抗漂白性能，饱和强度更低。应用于生物体成像时，需关注其饱和强度、粒径尺寸对样品标记的影响以及生物相容性等问题。
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有机纳米材料：包括聚集诱导发光点、聚合物点和荧光掺杂二氧化硅纳米粒子等。传统有机小分子染料聚集后会出现荧光淬灭现象，而“聚集诱导发光”现象为解决这一问题提供了可能。
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无机纳米材料：包括上转换纳米粒子、荧光纳米金刚石、量子点、碳点和局域等离子体共振混合物等。量子点具有独特窄发射光谱特性，适合多色成像；上转换纳米粒子具有上转换发光特性，成像无背景且光稳定；碳点具有更小粒径、更低细胞毒性、更好生物相容性和较低制备成本，可用于超分辨成像和荧光寿命成像；荧光纳米金刚石饱和强度更低，但尺寸较大且存在非特异性标记等问题，极少用于活细胞标记和成像。
二、基于单分子定位的低功率STED成像方法
定位STED：通过单分子定位原理提高分辨率，在相同连续型损耗光功率下，最高分辨率可达～15nm，而常规CW-STED技术分辨率约为60nm。该技术提升了STED的成像分辨率，降低了对损耗光的要求，使用连续型激光实现了与脉冲型技术相当的成像分辨率，但最终超分辨图像需要100-200帧图像序列重构，时间分辨率受限，且单分子定位依赖荧光分子的可逆闪烁过程，需要专用成像缓冲液以获得理想空间分辨率。
基于单分子定位的低功率STED成像方法原理图。（a）最小光子通量显微成像技术；（b）定位STED技术；（c）MINSTED技术
MINSTED：利用环形激发光的空心区域作为参考位置，通过受激辐射效应压缩有效点扩散函数，提高分辨率和分子定位效率。以聚集的线粒体蛋白Mic60为例，常规STED图像以60nm的分辨率未能区分单个蛋白分子，而MINSTED技术以2.1nm的定位精度可清晰区分。但实验中通常需要高功率损耗光以获得更高定位精度，会产生反斯托克斯背景信号和光损伤问题。该课题组通过将损耗光波长蓝移提高受激辐射截面系数，降低了高定位精度所需的损耗光功率，将空间分辨率和定位精度提升至亚纳米水平。
此外，研究人员提出自适应照明策略，如Protected STED技术，结合STED与RESOLFT技术的特点，额外引入两束光用于荧光团的激活和去激活，使荧光分子在暴露于损耗光束前处于“保护”状态，达到相同成像分辨率时，常规STED技术所需损耗光功率为7.6mW，而Protected STED技术仅需1.5mW，且图像信噪比在长时间成像后无明显变化。
三、基于图像信号处理的低功率STED成像方法
荧光发射差分显微技术：是一种与STED技术类似但不同的低功率超分辨成像方法，分辨率可达到激发波长的四分之一，适合活细胞成像。需要两幅图像：实心高斯激发光照射的共聚焦图像和相同波长空心环形光照射的负共聚焦图像，通过强度差分得到超分辨图像。常规顺序成像中，样品微小移动可能导致像素失配，影响超分辨图像质量。逐点差分策略可解决这一问题，即探测到实心高斯光激发的荧光信号后，立即调制照明光斑为环形光斑，采集同一位置的荧光信号，再调制回实心光斑并转移到下一个扫描点。利用共振振镜扫描时，因其驻留时间极短（~0.3μs），样品微小移动可忽略不计。
强度加权减法显微技术：根据两幅共聚焦图像之间的强度差，逐像素选择和分配最佳的权重系数，提高图像信噪比和分辨率，解决图像过度差分和失真问题。
数字增强型STED：通过引入增益系数等效代替STED成像中的损耗激光功率，降低STED成像对损耗功率的依赖性。实验表明，在实现相同分辨率时，该技术极大地降低了损耗光功率，减少了对生物样品的损伤和荧光染料的漂白。该课题组将其应用于HeLa细胞的三维成像，在1.3mW的损耗光功率下实现了 90nm的横向分辨率和200nm的轴向分辨率，展示了在活体三维超分辨成像方面的潜力。
但该方法面临样品漂移引发的像素失配问题，K值增加会伴随信号强度降低，导致图像信噪比变差，实际应用中性能还受成像深度、速度以及焦平面处损耗光束波前质量等因素制约。结合自适应光学校正波前像差可在低损耗光功率下实现对厚样品的超分辨率成像。
基于图像信号处理的低功率STED成像方法原理图。（a）数字增强型STED；（b）荧光时空调制型STED；（c）频域调制型STED
调制型STED：结合具有时间分辨探测能力的成像模块，通过荧光寿命成像技术同时采集共聚焦荧光信号和STED荧光信号，并通过数据处理得到纳米级时间分辨的两幅图像。实验表明，该方法在降低损耗光功率方面效果显著。对活细胞内微管的形态变化进行延时成像，在4分钟成像过程中，其采集到的图像分辨率稳定在90nm左右，而传统STED在相同损耗激光功率下的成像分辨率约为165nm。
频域调制STED：利用快速傅里叶变换算法将高斯和环形图像从空间域转换为频域图像，通过差分处理得到去除低频信息的频谱图，再通过傅里叶逆变换算法转换回空间域，最终得到超分辨图像。结果表明，该技术可有效提高STED图像的分辨率，保留图像原始信息并去除背景噪声，进一步优化图像信噪比。
四、基于时间分辨探测的低功率STED成像方法
时间门控法：通过设置合适的时间窗口，依据光子到达探测器的时间顺序去除短荧光寿命成分，保留长寿命荧光光子，压缩系统的有效点扩散函数。传统探测光路在损耗光脉冲结束后才开始探测光子，而时间门控法可在损耗光出现后经过特定延迟时间开始探测，剔除荧光寿命短的光子。
根据采集方式不同，可分为实时型和离线型。实时型采集和过滤过程同步，需复杂控制电路实现精确时间同步，通过实时调整时间窗口实现分辨率和信噪比的权衡；离线型先记录所有光子的到达时间，再灵活设置不同时间采集窗口，实现图像亮度与分辨率的动态平衡。时间门参数设置需谨慎，窗口过小会采集到未完全受激辐射的自发跃迁光子，降低图像分辨率；过大则降低信号强度，影响图像信噪比。
不同类型的STED系统中，时间门控法的应用效果不同，例如在CW-STED中，利用时间门控法筛选长寿命荧光光子，可在不增加激光功率的条件下提升成像分辨率；在pSTED中，由于损耗光脉冲小于1ns，时间门控法对分辨率提升有限。此外，多图像反卷积算法可恢复图像信噪比，选择长荧光寿命的染料可进一步发挥时间门控法的性能。
基于时间分辨探测的低功率STED成像方法原理图。（a）时间门控法；（b）荧光寿命调制的光子分离技术；（c）相量图分析法；（d）比例光子再分配技术
基于相量分析的光子提取技术：相量图分析是一种常用的荧光寿命数据分析方法，将时间域拟合转化为频域数学计算获得荧光寿命信息，无需拟合过程。在相量图法基础上提出的荧光寿命调制的光子分离技术，利用荧光寿命计算得到的每个像素中各成分的系数矩阵，通过矩阵提取长寿命光子，提升成像分辨率。
实验表明，该技术成像效果优于时间门控法，有效去除图像背景噪声并提升分辨率。结合深度学习的相量分析算法FlimGANE，可将低光子数荧光衰减转换为高度类似的高光子数衰减，产生去噪相位以恢复荧光光子的真实分布，自动确定相位点位置，消除实验偏差。例如，对COS-7细胞核孔复合物进行成像，结合FlimGANE算法后，分辨率可进一步提升。
比例光子再分配：同时提高低功率STED技术的图像分辨率和信噪比。引入矩阵表示在相同损耗光功率和样品条件下，长短寿命成分在图像中的比例，设置两个连续的时间门来确定系数矩阵，提取寿命较长的荧光团，在保证信噪比的同时进一步提高分辨率。
在相同分辨率情况下，该技术得到的图像比时间门控法具有更高的信噪比，能有效重新利用被时间门控法去除的早期光子，保留大量来自激发光斑中心的荧光光子，解决了时间门控法以牺牲图像信噪比来提升分辨率的问题。例如，对HeLa细胞微管进行成像，使用时间门控法的成像分辨率为110nm，而使用该技术后分辨率提升至108nm，实际图像信噪比得到进一步优化。
总结与展望
STED成像技术的应用与荧光探针的发展密不可分，适用于 STED成像的荧光染料应满足耐光漂白、低饱和强度和良好生物相容性的要求。为了使STED超分辨成像发挥最佳性能，高质量的样品制备必不可少。
未来，低功率STED超分辨显微成像技术的发展需要在优化图像质量、提升成像深度、智能化和自动化等方面进行深入研究。例如，提出受激辐射二次损耗技术，结合人工智能和深度学习提高恢复图像信噪比的效果和速度；将低功率STED技术与提高成像深度和光场调制的技术结合，探索和改进提升成像深度的方法；通过人工智能和机器学习技术实现STED系统成像参数的自动匹配、目标结构的自动识别和跟踪，创新设计和光学工程改进解决调试与校准耗时耗力且需专业操作的问题。
总之，低功率STED超分辨显微成像技术在生物医学成像方面具有巨大潜力，未来有望通过与其他先进技术结合，实现低功率的大深度、多色、快速的三维超分辨成像，为生物医学等领域的研究提供更强大的技术支撑。
内容来源：
周浩贤,王璐玮,张仁龙,林方睿,刘丽炜,屈军乐.低功率STED超分辨显微成像技术研究进展及展望[J].中国激光,2024,51(21):09.
DOI：10.3788/CJL240959
