探索与突破：深层生物组织光学技术的发展与应用

随着生物医学研究的不断深入，光学技术正逐渐展现出其独特的优势，比如：非电离辐射、高灵敏度和特异性、实时成像等。但其在深层生物组织成像中的应用仍存在一个主要的局限：由于深层组织对光的散射特性，目前的光学成像技术在深层生物组织中的分辨率和响应速度还无法很好地满足生物医学研究的需求。

香港理工大学的赖溥祥等人在《中国激光》发表了《深层生物组织光学技术发展及其应用（特邀）》的综述文章，介绍了光学技术在生物医学中应用的优势及局限性，梳理和总结了近年来研究人员在光-声结合和光学波前整形技术等方面的诸多探索，以及在生物组织操控、成像、光学计算以及人工智能等领域中的应用尝试。

为了实现深层生物组织清晰的光学成像，可以首先从物理原理出发，基于传统光学理论，对光学成像系统中影响成像深度的因素进行分析并给出对应策略。

波长转换

一般而言，可以通过使用长波长的光来增加生物组织中的成像深度。波长转换通过改变激发光的波长，利用波长更长的激发光增加成像深度。目前广泛应用的波长转换技术集中于多光子荧光、上转换过程以及近红外II区成像应用。

图1 单光子和双光子显微成像的对比。（a）单光子和双光子显微镜的原理示意图，单光子显微镜使用可见光连续波激光器作为光源，双光子显微镜使用飞秒近红外脉冲激光器作为光源；（b）拟南芥根尖的单光子（激发光波长为488nm和561nm）和双光子（激发光波长为980nm）成像结果对比，图中比例尺为50μm；（c）拟南芥花粉管的多色双光子成像，从花柱末端萌发的花粉管，图中比例尺为100μm；（d）通过双光子激发同时进行多色成像和激光烧蚀，对拟南芥根尖的根干细胞进行激光烧蚀，图中比例尺为50μm

能量转换

基于光声（PA）效应，将输入的光能量转换成超声波信号，减弱被探测信号的散射程度，从而提升成像的深度，主要包括光声断层扫描成像（PACT）、光声显微镜（PAM）以及结合光学内窥镜技术的光声内窥镜（PAE）。

图2 光声成像原理及其代表实现形态，譬如光声断层扫描成像、光声显微镜以及光声内窥镜的示意图。（a）光声成像原理，利用光热的吸收产生超声信号，通过探测超声信号来重建目标处的结构和功能信息；（b）透射式OR-PAM，超声波换能器（UT）和水浸聚焦透镜位于物体的相对两侧；（c）反射式OR-PAM，光声耦合器传输光但反射声，SOL是夹在两个棱镜之间的硅油层；（d）声学分辨率（AR）-PAM，激光束弱聚焦；（e）使用环形超声换能器阵列（ring UTA）的PACT；（f）使用线性超声换能器阵列（liner UTA）的PACT；（g）使用半球形超声换能器阵列（hemispherically UTA）的PACT；（h）使用二维法布里-珀罗干涉仪作为声传感器的PACT；（i）血管内PAE，外径为1.25mm；（j）线粒体的超分辨PAM图像，比例尺为300nm；（k）红细胞的ORPAM图像，比例尺为7μm；（l）人手掌皮下血管的AR-PAM图像，比例尺为1mm；（m）小鼠全身PACT图像，比例尺为5mm；（n）人手掌皮下血管的PACT图像

相位补偿

除了改变波长或能量转换的方法外，还可以通过对光场进行调控的方法来补偿被散射的光，增加穿透深度：光在透过生物组织等浑浊介质时，会发生波前畸变，导致成像质量下降，因此，可预先施加波前补偿，以校正生物组织光散射引起的畸变，从而提升成像质量。包括光学相位共轭（OPC）和直接的自适应光学（AO）。

图3 时间反演超声编码（TRUE）光学聚焦实验结果。（a）测量散斑相关时间（τc）与仿生模型（脂质-明胶）运动速度之间关系的光路图；（b）仿生模型以0.010mm/s速度移动时（τc=60ms）的散斑相关系数；（c）τc与仿生模型运动速度之间的关系；（d）TRUE的实验装置示意图；（e）仿生模型静止（τc>300s）时的实验结果，图中比例尺为1mm；（f）仿生模型以0.100mm/s移动（τc=5.6ms）时的实验结果；（g）仿生模型以0.200mm/s移动（τc=2.8ms）时的实验结果；（h）信号光频率移动100 kHz（τc=0.01ms）后，没有观察到时间反演光信号；（i）TRUE对吸收性目标成像的实验装置；（j）吸收性目标成像的实验结果

数字相位共轭

利用计算机算法及空间光调制器（SLM）来实现相位共轭，替代光学相位共轭（OPC）中依赖的相位共轭材料，实现更多应用场景，如光聚焦、图像边缘增强等。

迭代优化的波前整形

根据反馈信号调整入射光波前的相位，并经过多次迭代不断提升焦点的亮度，为深层组织中的光学聚焦与成像带来了全新的思路，但目前还无法在生物组织中实现实时聚焦。

传输矩阵方法

通过数学模型建立散射介质输入和输出之间的关系，预先推导出在空间不同位置实现聚焦所需的对应波前补偿图案，从而实现快速光栅化扫描，还可以找到具有高能量透过率的光通道，提升光在深层生物组织中的穿透深度。

反射矩阵方法

使用反射光替代透射光来构建散射介质成像模型，避免了侵入式测量，但现有的基于RM的方法由于依旧需要多次测量，并进行运算求解，无法在速度上匹配生物组织的去相关，故难以实现实际应用。

自相关成像

利用散斑自相关与物体自相关之间的关系，基于散斑恢复输入物体信息，但应用目前只限制于一些简单物体图案的重建。

图4 时间反演可控扰动与光声引导波前整形（PAWS）实验结果。（a）TRAP的概念图，SLM调制后的光被聚焦在散射介质内部的运动目标上；（b）TRAP的实验装置；（c）TRAP的实验结果，图中比例尺为500 μm；（d）TRAP优化前的散斑，图中比例尺为500μm；（e）PAWS的实验装置；（f）PAWS的聚焦结果，焦点大小为5.1μm×7.1μm，图中比例尺为20μm

图5 基于RM的光学聚焦。（a）三种类型的背向散射光子；（b）测量反射矩阵；（c）通过时间反演算子分离三种光子，然后利用波前整形在介质内聚焦光线

深度学习用于聚焦

通过训练深层神经网络（DNN），学习输入波前与输出波前之间的关系，直接给出所需的波前相位补偿，从而实现更高效的准确聚焦；或将DNN与迭代优化算法结合，可提升抗噪声能力。

深度学习用于成像

预先构建和训练深层神经网络（DNN），直接利用散射介质散射的散斑图案恢复原始图像，不再需要进行聚焦和光栅化扫描，可有力简化成像过程，提升成像速度。

图6 用于深层成像的生成对抗网络在远端聚焦的实验结果。（a）获取多模光纤透射散斑与反射散斑的实验装置；（b）基于DI-GAN使用反射散斑预测透射散斑，图中比例尺为10μm；（c）使用DI-GAN预测远端散斑后得到的聚焦结果，图中比例尺为10μm

图7 基于光学散斑的人脸识别加密系统流程图。（a）加密，将人脸图像（明文）加载到空间光调制器上，在激光穿过散射介质后，生成对应的散斑（密文）；（b）解密，将散斑输入到预训练的神经网络中进行解密；（c）人脸识别，将解密图像与已知人脸编码进行对比

深度学习用于染色

通过训练深层神经网络（DNN）来学习图像的染色映射关系，输入未染色的生物组织图像，网络输出标记后的目标区域，实现对生物组织图像的虚拟染色，具有更快、更低成本的染色优势，但需要大量数据进行训练，且对数据质量要求高。

光纤荧光内窥镜

具有微创、可弯折和成本低等优势，通过将光纤荧光内窥镜插到生物体内部，可以实现对深层组织的高分辨率成像，但MMF中同时存在许多光模式，输出端会形成类似散斑的图案，故无法直接使用MMF传输清晰图像，需要利用上述技术重建图像。

图8 超薄光纤束内窥镜。（a）直径为350μm的10000芯光纤束，比例尺为50μm；（b）光纤束和一欧元硬币的对比；（c）传统微型内窥镜成像，样品需要靠近光纤端面；（d）利用FAST算法，样品无需靠近光纤束端面，即可基于远场散斑重建目标图像；（e）实验装置

光纤光声内窥镜

将PAM技术与MMF相结合，开发出光纤光声内窥镜，可用于深层生物组织中的超声信号检测。

图9 光纤光声内窥镜及成像示意图。（a）内窥镜探头结构图，包括用于激光传递和聚焦的梯度折射率（GRIN）光纤和用于超声检测的激光传感器；（b）焦点处的横向分辨率为7.4μm；（c）不同深度的横向分辨率；（d）小鼠耳的血红蛋白浓度（CHb）、血氧饱和度（sO2）以及深度信息标定的血管实验结果，图中比例尺为1mm

基于光纤的光遗传学研究

利用光纤将激光传输到特定目标区域，激活光敏蛋白质并记录其产生的荧光信号，实现对特定细胞或组织的神经活动成像，有望揭秘大脑的功能奥秘。

图10 基于多模光纤的精准光遗传学调控。（a）（b）生物组织的散射导致无法精确调控；（c）双光子激发可以刺激单个目标神经元并增加光子的穿透深度；（d）（e）通过微创多模光纤结合波前整形，可以在大视场中精确调控神经元；（f）结合多模光纤与波前整形，可以透过头骨进行聚焦，实现无创深层神经元调控；（g）~（l）利用波前整形增强的多模光纤，实现选择性光遗传学调控的体外钙离子成像的结果，刻度尺为50μm

深层生物组织光学的发展前景越来越广阔，基于物理模型的传统光学与基于计算、数据驱动的深度学习相结合，大大提升了光学系统的成像深度和成像速度。基于理论、模型、数据、应用相结合的光学系统设计，是未来深层生物组织光学的重要发展方向。随着算力的提升以及大模型等深度学习技术的发展，未来深层生物组织光学会出现突破性进展。

此外，基于光纤的微创深层生物组织聚焦、成像已经取得了广泛应用，尤其是在光遗传学的神经元调控及成像中已经有多个研究成果，上述深层生物组织光学聚焦、成像的研究成果也可应用于基于光纤的微创深层生物组织研究。

声明：本文仅用作学术目的。内容及图片来源于《中国激光》、《深层生物组织光学技术发展及其应用（特邀）》；DOI：10.3788/CJL231318；如涉及版权问题，可联系工作人员删除处理。

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