无微不“视”：520nm激光助力微血管成像研究

微血管由体内最小的血管组成，是心血管系统的基本功能单位。对这些微血管网络的形态学评估为理解各种疾病的起始和发展提供了独特的视角，如感染、高血压、糖尿病、缺血和癌症。此外，微血管网络的三维成像对于疾病诊断具有重要价值。

尽管在过去几十年中，开发无创高分辨率成像技术来观察血管生成在其原生环境中的顺序和空间进展取得了长足的进步，但磁共振血管造影（MRA）、计算机断层扫描（CT）、超声成像、光声显微镜（PAM）、光学相干断层扫描（OCT）和双光子激发荧光显微镜（TPEM）等相关技术依然存在着各自的局限性。

来自中国的科研团队在《Optics Letters》发表了文章，提出了一种使用520nm飞秒光纤激光的时间分辨双光子激发显微镜系统，为解决这一问题提供了新的思路。

为了验证该系统激发血红蛋白及其光产物自发荧光信号的能力，研究团队针对不同场景设置了多次实验。

对小鼠RBCs进行成像

清晰地可视化了RBCs的典型甜甜圈状形状，荧光衰减曲线表明RBCs的荧光寿命极短，且荧光强度与激发功率呈二次依赖关系，证明信号确实来自双光子激发。

图1.血红蛋白及其光产物的双光子激发自发荧光信号。（a）小鼠红细胞的TPEM成像。（b）荧光强度衰减与系统响应相似。内图显示荧光强度与激发功率的二次依赖性。（c）使用双光子激发自发荧光成像对小鼠耳皮肤的体内成像。（d）从（c）中提取的血管图像。（e）小鼠耳皮肤血管的自发荧光图像和（f）使用尼康A1MP显微镜在700纳米激发下的FITC荧光图像。在（a）中，比例尺：5μm。在（c）-（f）中，比例尺：50μm。

对小鼠耳皮肤进行成像

能清晰地识别出毛囊和血管，与使用外源性染料标记的血管相比，该系统在不使用任何染料的情况下能清晰分辨血管图像，且图像质量相当。

荧光寿命成像（FLIM）技术

通过计算每个像素的荧光寿命，获得了颜色编码的荧光寿命图像，能清晰识别微血管。

图2.血管的深度分辨自发荧光图像。从不同的荧光寿命中提取血管。（a）小鼠耳在不同深度的自发荧光图像。（b）（a）的颜色编码荧光寿命图像。（c）根据短荧光寿命确定的血管图像。比例尺为50μm。

对小鼠耳肿瘤模型进行成像

成功获得了肿瘤和正常组织中具有高信噪比的微血管图像，肿瘤血管更加混乱和曲折，验证了肿瘤血管与正常血管在形态特征上的显著差异。

图3.小鼠耳肿瘤血管的TPEM体内成像。（a）和（b）小鼠耳肿瘤模型的照片。（c）和（d）从520纳米激发的深度分辨TPEF图像重建的微血管网络的3D图像，（c）为正常区域，（d）为肿瘤区域（详见可视化1和可视化2）。小鼠耳体内正常区域（e）和肿瘤区域（g）血管的最大强度投影（MIP）图像

总的来说，该研究构建的使用520nm fs光纤激光作为激发源的时间分辨TPEM系统，能够在不使用外源性对比剂的情况下对生物组织中的微血管进行体内3D高分辨率成像，具有重要的临床应用潜力。未来可通过结合自适应光学或生物组织的光学清除技术，进一步提高成像深度。

内容来源：

1.《In vivo label - free two - photon excitation autofluorescence microscopy of microvasculature using a 520 nm femtosecond fiber laser》. https://doi.org/10.1364/OL.394242