先进成像 | 快速荧光寿命显微成像技术及其在活体应用的研究进展

荧光寿命显微成像（FLIM）已经广泛应用于生命科学研究领域，具有高灵敏和高特异性的特点，在对组织微环境进行定量表征方面具有独特优势，但由于成像速度相对较慢，限制了FLIM的活体应用。近年来，随着光电子器件和人工智能等技术的发展，开启了FLIM活体成像新篇章。

• 时域（TD）法，如图1（a）~（d）所示，主要包括时间相关单光子计数（TCSPC）法、脉冲采样（PS）法、门控（TG）法及条纹相机（SC）法；

• 频域（FD）法，如图1（e）所示。

图1 TD-FLIM和FD-FLIM的原理简图

1.1 TCSPC-FLIM

TCSPC是目前应用最广泛的荧光寿命测量技术， 它可以和扫描成像或者宽场成像相结合。以其结合传统共聚焦扫描技术为例，通过使用高重复频率的脉冲激光，对样品进行逐点扫描，每个像素点所产生的单光子信号被光电倍增管（PMT）或雪崩光电二极管（APD）等高灵敏探测器收集，通过计时模块分析光子到达探测器的时间，并将结果记录在“到达时间-光子数”直方图中。

1.2 TG-FLIM

TG-FLIM是一种宽场荧光寿命测量技术，通过脉冲光源和门控探测器的配合，控制荧光信号的获取时间和探测频率。具体操作是在脉冲激光激发后不同时刻选通成像，获取一系列荧光强度图像来记录荧光衰减。与TCSPC-FLIM类似，TG-FLIM同样需要高重复频率的脉冲光源及对荧光强度衰减曲线进行拟合；但TG-FLIM对单组分的荧光寿命进行测量时理论上只需要记录两个不同时间延迟的荧光强度图像 ，是各类FLIM技术中速度最快的。

图2 基于光片技术的TG-FLIM系统。（a）系统示意图；（b）对活体斑马鱼的成像结果

1.3 PS-FLIM

近年来，发展出一种直接且快速的荧光寿命测量方法：在样品被单个脉冲光激发后，利用高采样率和宽带宽的数据采集模块直接记录荧光衰减曲线，该方法称为PS-FLIM 。

为了有效实施这个方法，需要满足以下条件：

1.4 SC-FLIM

使用条纹相机（SC）作为探测器，可以实现高时间分辨率的FLIM，在SC的二维光电阴极上，一个维度用于反映时间信息，另一个维度则记录空间信息或者光谱信息。SC的工作需与脉冲光源时序同步，以保证单次测量的荧光信号来自同一激发脉冲。通过柱透镜或一维振镜对样品进行线扫描激发，并使其与狭缝耦合。不同时刻到达光电阴极的荧光光子受到SC内部扫描电场的作用，偏转不同角度并轰击SC荧光屏靶面的不同位置，从而记录时间信息。

图3 用于快速成像的SC-FLIM技术。（a）基于双螺旋点扩散函数工程的单粒子追踪FLIM［67］；（b）基于压缩感知的DMD空间编码

1.5 FD-FLIM

荧光信号的产生频率与激发光的信号同步，但是会有幅度的减小和相位的延迟。根据这一原理，Wang等提出了一种基于调制系数M、角频率为ω和相位延迟Δφ来计算荧光寿命的频域荧光寿命显微成像技术（FD-FLIM）。这种方法对设备要求不高，常用连续的激光器作为光源，对激发光进行正弦调制，并解调测得的荧光信号从而得到荧光寿命。

图4 调制LED光源的宽场FD-FLIM。（a）光路示意图；（b）不同比例荧光素-甘油混合溶液的荧光强度成像结果；（c）对应的荧光