离体光透明在器官3D成像的应用

       组织透明化三维成像技术透过对大型、复杂、异质的医学或生物样品的三维高清成像，深入探讨可能的病理、生理功能和机制。样品可以是多种来源（人、猴、鼠等）的各类组织，特别是复杂结构的组织，如大脑、胚胎、器官球状体或活组织切片。该技术通过使用增强的光学穿透深度来捕获整个器官的荧光信号，并在同一组织标本上多轮染色重构，探索二维成像难以企及的神经血管网络、神经纤维投射、蛋白/mRNA的空间分布和不同物质见的相互作用等。

       了解大脑功能是一项具有重要临床意义的基本科学目标。大脑的复杂性阻碍了这一目标的实现。人脑中大约有860亿个神经元（老鼠有7500万个），这些神经元在复杂的神经回路中相互作用。传统成像研究要么空间尺度差（只检查较大大脑网络的一小部分），要么空间分辨率差（检查较大网络，但以了解微观结构为代价）。大脑的脂质含量很高，这使得它不透明，限制了光线的穿透深度。穿透脑组织的光被散射，从而产生无法定位点光源的失焦图像。因此，大脑的高脂含量使得在中尺度成像变得特别困难。

       为了克服这一障碍，大多数实验涉及在组织染色、成像和定量之前将大脑切成相对较薄的切片（20-50µm）。然而，大脑切片有其自身的缺点。例如，即使在相对较薄的脑切片中，光仍会继续散射，切片可能会损坏和/或扭曲组织，即使试图精确重建3D图像，切片组织中的许多丰富结构信息也可能丢失。例如，切片的脑组织可能无法捕捉到神经元投射的全部范围（可能延伸数百微米），因此提供了神经元分支和脊椎密度区域变化的不完整视图。解决这一限制的一种方法是将切片机耦合到显微镜上的成像。在切割每个切片之前获取大脑的平铺图像，以生成完整组织的三维重建。这项技术有不同的局限性，因为它无法对组织进行免疫标记，并且在成像后需要大量的努力来对齐切片。检查组织的理想方法是用显微镜检查完整的组织，而不是切片的组织。而新的透明技术克服了这些限制。

（透明前后对比图）

碘化丙啶染色，使用共焦显微镜成像，荧光信号深度可达2000微米

       神经元有多种类型，其复杂性和大小使得传统组织学方法很难完全分析它们的形态。高尔基染色可用于分析相对较厚组织切片中的分支和脊椎密度，但该技术难以与免疫组织化学结合，进行更详细的分析。荧光标记神经元的成像能结合形态学分析和免疫组织化学，但在没有光透明的情况下，可以使用的切片厚度非常有限。因此，神经元形态学的分析通常只基于整个神经元的一部分，或者需要复杂且耗时的重建。在光透明组织技术中，神经元成像很简单，因为整个神经元无需物理重建即可可视化。除了在z轴上获得的信息外，由于组织的透明性质，清晰度产生具有高信噪比的图像。这使得光透明技术成为神经元完整形态自动分析的理想选择。

       A、绿色荧光蛋白标记的锥体神经元成像。B-E为同一神经元不同深度的假设切片成像（连续40微米假设切片），表明单个40微米截面的树突不能完整体系神经元的完整性。F和G为同一神经元40微米切片，对比完整神经元追踪。H是神经元Y轴，内框是40微米标准切面，其余是会损失的树突轴。I–L，使用追踪神经元的顶端和基底树突自动收集的示例数据。将完整的神经元与以细胞体为中心的单个40µm厚的神经元部分进行比较。

      其他器官也可以使用光透明成像技术。如脊髓、肠、肺、脾、肠、睾丸、肾、肾上腺、皮肤和肌肉。

A、 小鼠脾脏在组织透明前后及免疫组织化学CD34低倍和高倍图像。B、 用碘化丙啶染色的光透明小鼠肠道。C的小鼠肾脏透明，平滑肌肌动蛋白标记。D、 用碘化丙啶染色的小鼠睾丸。E、 小鼠肺胶原免疫标记。F、 用碘化丙啶染色的小鼠肌肉切片。所有的荧光图像都是用光片显微镜拍摄的，除了脾脏的高倍率图像是用共焦显微镜捕获的。