活体光透明在双光子神经成像的应用

       1931年，M.Goppert-Mayer提出双光子激发，该过程是指两个低能量光子叠加激发出一个高能量光子。在1990 年，这种光子激发模式被Denk和Webb应用到生物显微成像领域。相较于传统的共聚焦显微镜，其具有以下几方面优势:

 1、穿透深度深。生物组织对700-1100nm范围内光的吸收和散射系数较小，因此双光子成像的激发光在组织中的穿透深度相较于传统光学成像技术而言有显著的提升;

2、分辨率高。活体水平双光子成像具有较高的时间空间分辨率,双光子仅在焦点处激发荧光，故无需孔径光阑滤光，从而有效提高图像的信噪比与信号强度;

 3、光毒性小。在双光子显微成像中，组织对光子的吸收仅发生在聚焦区域，对周围细胞的损伤较小，极大地延长了可观测时间。

（利用长波长激发样品，穿透能力强；只有焦平面的荧光分子被激发，不需要共聚焦的针孔去掉非焦平面的信息）

       在研究血脑屏障，运用双光子显微镜观察小鼠大脑皮层血管和神经时，皮层上方包覆的浑浊颅骨组织具较高的散射特性，严重制约了光在组织中的穿透效率及深度等。无论从皮层成像检测的角度，还是皮层光操控的角度，研究人员都需建立一个合适的颅窗，以克服颅骨对光的阻挡。目前的颅窗技术均基于外科手术方法，如基于颅骨磨薄手术的磨薄颅窗、基于开颅手术的开颅玻璃颅窗以及其他衍生的颅窗等。但无论是开颅玻璃颅窗、磨薄颅窗还是相关的衍生颅窗都存在各种问题。严苛的技术操作要求、诱发的急性炎症反应、有限的成像次数等均限制了活体皮层光学成像研究的发展。因此，活体颅骨透明是为解决生物组织高散射的问题提供了重要手段。

图为颅骨透明后效果图，可以明显肉眼看见皮层血管。

图:1、透明前经；2、光透明试剂作用15 min后，可观察到丰富的皮层血管；3、经过生理盐水的充分擦洗和干燥后，颅骨可恢复至原来的浑浊状态；4、再次对其做颅骨光透明操作后，颅骨依然能够被有效透明，且透明效果与第一次透明效果一致，这说明该光透明颅窗具有高效、可开合的特性；5移除了观察部位的颅骨，可以发现移除颅骨后观察到的皮层血管结构与透过光透明颅窗观察到的信息是完全一致的，大小血管均清晰可辨。

颅骨透明前后神经树突的荧光成像，a和b显示脑膜表面以下10–15和60–65μm深处Thy1 YFP神经元图像。

       光透明前后，通过完整颅骨的树突正交（x–z）投影，除荧光强度显著增加外，透明后深度也明显增强（成像参数和数据处理相同）。比例尺=10μm。